家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace在毕赤酵母GS115中的表达及其分析

【目的】构建表达家蚕乙酰胆碱酯酶（BmAChE）的毕赤酵母菌株,实现BmAChE在毕赤酵母中分泌表达并对其活性进行分析。【方法】从家蚕头部提取总RNA,经RT-PCR反转录成cDNA,通过PCR扩增出家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace并进行序列测定。采用PCR及重叠延伸PCR去除原bmace中的信号肽和疏水肽,并对序列中存在的2个A+T富含区进行同义密码子替换的改造。将改造后的bmace与表达载体pPIC9K连接,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白,以Ellman法测定酶活力,毒扁豆碱和有机磷及氨基甲酸酯类农药抑制试验分析重组BmAChE（rBmAChE）的生物活性。【结果】改造后的bmace经重组毕赤酵母菌株分泌表达了1个分子量约为70 kD的蛋白,具有AChE活性,酶比活力约为1 187 U•mg-1。抑制试验显示,该rBmAChE能够被毒扁豆碱强烈抑制,并且可被皮蝇磷等10种有机磷农药和克百威等5种氨基甲酸酯类农药抑制,最低抑制浓度IC50值可达2.78×10-10 mol•L-1。【结论】成功构建分泌表达BmAChE的毕赤酵母菌株,其表达了具有良好活性的rBmAChE,可用于进一步制备有机磷及氨基甲酸酯类农药快速检测分析制剂。     

抗克伦特罗重组抗体发酵条件的优化

为提高抗克伦特罗(clenbuterol,CBL)单链抗体(single chian Fv,seFv)的表达量,考察了Mg2+、Ca2+、NH4+、NaHPO4-等无机离子,初始pH值以及装液量对重组抗体表达量的影响.优化试验结果表明,重组大肠杆菌E.coli BL21在初始pH值为7.2、含2 mmol/L Ca2+和20 mmol/L NaHPO4-的培养基中培养,装液量为25 mL,42℃诱导表达后抗CBL-scFv的表达量为33.7%.     

涂膜和热处理对葡萄能量和贮藏生理及品质的影响

研究不同处理对欧亚种"维多利亚"葡萄组织能量水平和生理品质的影响。采后葡萄经钙联合涂膜和热处理,即在质量分数为0.2%Ca Cl2和1%壳聚糖中浸泡20 min,45℃的0.2%Ca Cl2溶液中浸泡20 min,晾干后(4±0.5)℃贮藏,每10d测定果实的呼吸强度、褐变指数(browning index,BI)、腐烂率、硬度、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、单磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)的含量,多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)、过氧化物酶(peroxidase,POD)、脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)和超氧化物歧化酶(soperoxide dismutase,SOD)活性变化,以未处理为对照。结果显示对照组葡萄组织中能量物质处于亏损状态,呼吸强度减弱,细胞膜氧化增加,膜透性、BI、腐烂率增加,PPO、POD和LOX活性增加,SOD降低,果实软化。钙联合热和涂膜处理较好维持了果实的能量水平和生理品质,且涂膜优于热处理。ATP与硬度、SOD显著正相关(r=0.938,0.930,P0.01),与MDA、膜透性、LOX显著负相关(r=-0.896,-0.932,-0.940,P0.01);能荷(energy charge,EC)值与膜透性、LOX负相关(P0.05),与呼吸强度和SOD活性正相关(P0.05)。随贮藏时间的延长,葡萄组织的能量水平处于亏损状态,能量水平显著影响生理品质。经适当的采后处理可延缓能量亏损,涂膜优于热处理。     

丁草胺荧光偏振免疫分析——示踪物的合成与鉴定

【目的】为建立除草剂丁草胺的荧光偏振免疫检测方法,对关键试剂示踪物进行合成与鉴定。【方法】以异硫氰酸荧光素、乙二胺和己二胺为原料,合成了异硫氰酸荧光素乙二胺（EDF）和异硫氰酸荧光素己二胺（HDF）两种中间体,薄层层析法分离出目标产物,电喷雾电离质谱法鉴定;然后将5-氨基荧光素（AF）、EDF、HDF分别与丁草胺半抗原（BMPA）连接,得到3种不同间隔臂的示踪物（BMPA-AF,BMPA-EDF和BMPA-HDF）,利用抗血清稀释曲线测定抗血清效价,竞争抑制曲线测定不同示踪物检测灵敏度。【结果】3种示踪物合成成功,抗血清稀释曲线和竞争抑制曲线显示3种示踪物的抗血清效价分别为1/600、1/1500和1/600,半抑制浓度分别为1 292、433和298 ng•ml-1。【结论】合成出3种不同间隔臂的丁草胺示踪物,对示踪物的性质进行初步研究,为下一步建立丁草胺荧光偏振免疫分析方法奠定了基础。     

农药克百威单链抗体基因构建及蛋白结构模拟

构建小分子农药克百威(CBF)单链抗体(scFv)基因cbf,进行蛋白质二级、三级预测并对其理化特性进行分析。采用重叠延伸PCR方法,以能特异性分泌抗CBF单克隆抗体的杂交瘤细胞株5D3为原料,构建抗CBFscFv基因cbf,进行测序,采用生物信息软件对氨基酸序列推导并进行结构预测,同时对理化性质进行分析。结果得出,抗CBFscFv基因cbl全长750bp,对应228个氨基酸,单链抗体分子量约为26315.1,等电点预测值5.66,为酸性蛋白质;二级结构显示抗克伦特罗单链抗体含α螺旋18处,β折叠108处,β转角24处,随机卷曲93处。cbf三级结构建模显示VL和VH符合scFv的结构特点,可观察到6个环区形成疏水的"口袋",具有抗原结合位点的空间构象。从而构建了一个抗CBFscFv基因cbf,应用信息学技术所获得的预测和分析结果为抗克伦特罗单链抗体的进一步表达、纯化和活性研究提供了大量的信息。