马蔺cbf转录因子的克隆及序列分析

根据GenBank已发表的拟南芥cbfs转录因子基因序列设计特异性引物, 采用PCR和RT-PCR方法, 从鸢尾科野生花卉马蔺基因组DNA和cDNA中克隆出cbf转录因子基因片段, 将其克隆到pMD18-T-Vector上。经序列测定及分析表明, 两种途径得到的cbf基因序列相同, 基因全长642 bp, 可编码213个氨基酸。同源性分析表明该基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其它植物cbf类基因具有同源性, 尤其与拟南芥cbf1和黄瓜cbf1基因有很高的同源性, 氨基酸同源性高达97%。鉴于同cbf1基因高的同源性, 初步确定克隆到马蔺cbf1转录因子基因, 命名为Ilcbf1, 在GenBank中登录号为DQ131497。     

具有蛋白酶体β7亚基功能的棉铃虫HaProβ7基因的克隆与序列结构及表达研究

以棉铃虫中肠总RNA为模板,利用快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆了棉铃虫蛋白酶体β7亚基基因的cDNA序列,并对所得基因进行了序列分析。结果表明:棉铃虫蛋白酶体β7亚基基因的cDNA序列亚基全长1 007 bp,命名为HaProβ7(GeneBank登陆号:FJ378902),包含1个846 bp的完整开放读码框(ORF)序列,编码蛋白质为281个氨基酸残基,预测分子量30.07 kD,等电点为8.04。HaProβ7蛋白质在40～229氨基酸残基位置为蛋白酶体β7亚基的保守区域。Clustal W进行多序列比对发现,HaProβ7编码蛋白质与果蝇等昆虫蛋白酶体β7具有63%以上的同源性,蛋白酶体β7的保守区域高度一致。邻近(NJ)法分子进化分析也显示,HaProβ7编码蛋白质与其它生物蛋白酶体β7进化上同源。基因表达谱分析结果表明,Haproβ7在体壁、中肠和生殖腺中表达量较高,在头部表达量最少。     

荔枝APETALA1（AP1）同源基因cDNA全长克隆及其表达研究

 应用RT-PCR方法克隆得到荔枝AP1同源基因cDNA全长,命名为LcAP1（基因登录号：JN214349）。LcAP1基因开放阅读框738 bp,编码245个氨基酸,推测蛋白质分子量为28.39 kD,等电点为9.69。序列分析显示,LcAP1基因编码的蛋白在1 ~ 61氨基酸含有1个MADS盒结构域,在89 ~ 179氨基酸有1个K盒结构域。蛋白质二级结构预测表明,LcAP1基因编码的蛋白有3个α螺旋,2个β折叠区,8个β转角。同源分析表明,LcAP1基因在不同植物中的一致性为72% ~ 82%。半定量RT-PCR分析表明,在‘三月红’荔枝花芽分化期,LcAP1基因在成熟叶、幼叶、老茎、嫩茎、花芽和花梗中均表达,在花芽中表达最多。     

扁桃AcCBF1转录因子的克隆及表达分析

【目的】分离和克隆新疆栽培扁桃CBF1转录因子基因,了解其在扁桃响应环境胁迫和逆境相关激素诱导的表达情况。【方法】以新疆扁桃幼苗为试验材料,对其进行低温、干旱、盐及ABA处理,使用PCR技术从新疆扁桃‘双果’克隆得到CBF1转录因子基因,通过农杆菌将35S-Ac CBF1-GFP融合质粒转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察结果,并通过实时荧光定量PCR技术分析了SG-Ac CBF1转录因子基因在不同非生物逆境胁迫下的表达情况。【结果】序列分析表明,该基因编码框为729 bp,编码242个氨基酸,蛋白质分子量为27.405 ku,命名为SG-Ac CBF1,GenBank登录号为KM245571。氨基酸序列同源比对分析证实,SG-Ac CBF1属于CBF转录因子家族基因。系统发育树分析表明,SG-Ac CBF1与甜樱桃Pa DREB1的亲缘关系最近。亚细胞定位分析显示,SG-Ac CBF1蛋白定位于细胞核中。实时荧光定量PCR分析结果表明,低温、干旱、盐及ABA均能诱导SG-Ac CBF1基因表达。【结论】SG-Ac CBF1转录因子具有核定位功能,并参与了植物对逆境胁迫的调控。由于该转录因子属于家族基因,因此其对环境胁迫响应的强弱还有待探讨。     

灰树花己糖转运蛋白的生物信息学分析

以灰树花转录组数据为参考，筛选到己糖转运蛋白（GfHXT2）的c DNA序列，利用生物信息学方法对GfHXT2蛋白的理化性质、亲/疏水性、信号肽、亚细胞定位分析、跨膜螺旋结构、保守结构域、二级结构、三级结构、蛋白修饰位点和蛋白交互网络等方面进行预测和分析。结果表明：GfHXT2基因cDNA总长1 871 bp,CDS共编码380个氨基酸。综合分析GfHXT2基因蛋白质亲水和疏水的得分和理化性质分析结果，判定其为较稳定的亲水蛋白，不含信号肽，亚细胞定位分析结果表明其在内质网的概率为55.6%，跨膜螺旋结构数量为10个。GfHXT2蛋白的二级结构存在4种状态，分别为α螺旋、无规则卷曲、延伸链和β转角。存在4个N端糖基化位点、3个O端糖基化位点。GfHXT2蛋白与13个蛋白质互作，即共同参与某一功能。     

杧果叶绿素a/b结合蛋白基因cDNA全长克隆及其序列分析

采用RT-PCR方法克隆得了杧果叶绿素a/b结合蛋白基因(Cab)cDNA全长序列,命名为Mcab(GenBankaccession No.FJ907952)。Mcab基因全长为915bp,编码264个氨基酸,推测蛋白质分子质量为28.19ku,等电点为5.35。同源性分析表明,Mcab基因在不同植物中的一致性为72%～85%。实验分析表明,杧果Mcab基因编码的蛋白中第63～232位有一个捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域,并且在木本植物中非常保守。亚细胞定位分析显示Mcab蛋白被定位于叶绿体,它所编码的蛋白质在绿色植物光合系统中起着重要作用。蛋白二级结构预测显示,Mcab蛋白有8个α-螺旋,5个β折叠区,21个β-转角。研究将有助于进一步了解杧果光合作用的分子机制。     

黄瓜NBS类抗病基因类似物的生物信息学分析

利用生物基因组学数据库,对黄瓜NBS类抗病基因类似物(RGA基因)进行生物信息学分析,以预测RGA基因编码产物的理化性质、结构与功能,为进一步研究黄瓜抗病调控机制提供一定的理论依据。结果表明:RGA基因编码产物为一个长度达84个氨基酸的蛋白,其理论分子量为10 964.32Da,理论等电点为PI 9.36,不存在跨膜区域,主要定位在细胞质中;进化比对表明,黄瓜的NBS类抗病基因在亲缘关系上与西瓜最近,其次是丝瓜;二级结构为α-β型,具有较为明显的3个螺旋和2个折叠;具有酰化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点3个功能位点;预测RGA基因编码产物主要充当辅酶角色参与生化反应的调控,介导基因表达调控,在抗逆相关的信号通路以及种子胚的发育等过程中发挥重要的生理功能。     

西瓜嗜酸菌tatB基因生物信息学分析

为了解西瓜嗜酸菌（Acidoworax citrulli）双精氨酸转运系统（Twin—arginine translocation system,Tat）关键基因tatB的生物信息学信息,利用相关软件对西瓜嗜酸菌和其他7种革兰氏阴性菌的TatB蛋白进行理化性质分析,氨基酸序列分析以及遗传距离分析;同时对西瓜嗜酸菌TatB蛋白的疏水性、跨膜结构域以及三级结构模型进行了预测。结果表明,西瓜嗜酸菌TatB的理化性质和洋葱布克氏菌（Burkholderia cenocepacia）更加接近,水稻自叶枯病菌TatB理化性质与其他6种细菌的相差较远：西瓜嗜酸菌TatB蛋白遗传关系与水稻自叶枯病菌（Xanthomonasoryzae）的最远,与洋葱酸皮病菌以及茄科雷尔氏菌（Ralstoni0solanacearum）的较为接近;预测西瓜嗜酸菌TatB蛋白有3个区域的疏水性比较高．在氨基酸序列的2．18位以及100～106位有2个跨膜区域,其三级结构可能为“L”型。对西瓜嗜酸菌tatB基因进行基本生物信息学分析,丰富了其生物信息学资料,有助于对西瓜嗜酸菌的致病机制进行深入研究,为以后选育抗病品种以及研发特异性的新药提供依据。     

筇竹CBF1基因的原核表达和多克隆抗体的制备

以筇竹（Qiongzhuea tumidinoda Hsueh et Yi）叶片为试材,采用RT-PCR方法克隆其CBF1基因,并将CBF1连接到原核表达载体pET32a（+）上,经克隆测序确定所构建的重组载体pET32-QZ开放阅读框正确。将重组载体pET32-QZ转化大肠杆菌Rosetta2（DE3）菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,证明CBF1蛋白得到了高效表达,所表达蛋白是大小约为45 kD的融合蛋白。经镍柱纯化后作为抗原免疫家兔,制备CBF1蛋白特异性抗血清。所制备的多克隆抗体能够与融合蛋白和经冷诱导的筇竹叶片总蛋白在25 kD处出现杂交条带。上述结果表明,表达的目的蛋白可用于免疫组织化学、蛋白质印迹检测。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

以‘丰香’草莓为试材,通过SON-PCR结合RT-PCR技术获得了1个冷诱导转录因子CBF/DREB家族基因编码区全长cDNA序列,命名为FaCBF1,GenBank登录号为FJ767754。该基因包含1个长为636 bp的完整开放阅读框,编码211个氨基酸,预测分子量为23.4 kD,等电点为6.53。氨基酸同源性分析表明,FaCBF1与GenBank中登录的蔷薇科植物CBF/DREB具有较高的同源性。进化树分析表明,草莓FaCBF1与近缘属的月季、苹果和沙梨处于同一进化枝上,而与李属植物进化关系较远。半定量RT-PCR分析显示,FaCBF1能被低温、干旱和高盐胁迫诱导,但对ABA诱导不敏感;在同一诱导时期在根中的表达量高于叶和茎中的表达量。     

Purification of an anti-HBsAg scFv and measurement of its affinity constant

AIM: To purify and refold the inclusion body of a human anti-HBsAg scFv with a 6×His tag, and to determine the affinity constant of the purified recombinant product.METHODS: Solubilizing in buffers containing urea or guanidine hydrochloride(GuHCl), the inclusion body was purified by IMAC, and then refolded by dialysis against urea or GuHCl, at the same time, Ni²⁺ charged chelate column was utilized for in situ refolding. The affinity constant of the refolded scFv, polished by immune-affinity chromatography, was determined by non-competitive ELISA. RESULTS: The refolded scFv with highest specific bioactivity was produced by dialysis against GuHCl. Under this condition, the recovery of target protein reached(61.08±1.45)%. The affinity constant of the polished scFv was confirmed to be(2.30±0.32) ×10⁷ L/mol. CONCLUSION: The inclusion body studied in this paper can be refolded efficiently under optimal dialysis condition in vitro. The antigen-binding property of this recombinant scFv is not affected by the purification tag fused to the N terminal of the protein.     

Construction of pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ eukaryotic expression vector and expression in NIH 3T3 cells

AIM: To construct a recombinant eukaryotic expression vector pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ and detect its expression in NIH 3T3 cells.METHODS: CD28-ζ cDNA was amplified from the plasmids pBULLET and inserted into pLNCX vector that contained anti-CD20 scFv/IgGFc/CD80 gene.The recombinant plasmids were transfected into NIH 3T3 cells,and resistant clones were obtained by G418 selection.The gene expression of the fusion protein was determined by RT-PCR and FACS.RESULTS: The recombinant eukaryotic vector was constructed successfully,determined by PCR and enzyme digestion analysis.The target gene was amplified from NIH 3T3 cells transfected with the vectors by RT-PCR.The FACS showed that recombinant protein was expressed in NIH 3T3 cells.CONCLUSION: Construction of pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ expression vector and its expression in NIH 3T3 cells lay the foundation for further research of generation of modified T lymphocytes to CD20 positive lymphoma.     

2013—2016年辽宁省蔬菜质量安全状况分析

根据2013—2016年辽宁省农产品质量安全例行检测的蔬菜样品合格率、蔬菜种类和超标农药种类等数据,分析得出:蔬菜样品合格率(后10名)由高到低排序为辣椒、大白菜、叶用莴苣、普通白菜、茼蒿、苦苣、菠菜、芹菜、韭菜、豇豆;从蔬菜样品合格率的变化趋势来看,番茄、黄瓜、茄子属于稳定型,芹菜属于增长型,辣椒、韭菜、普通白菜、叶用莴苣、茼蒿属于离散型.农药超标位于前10名的农药由高到低排序为克百威、毒死蜱、氧乐果、腐霉利、氟虫氰、吡虫啉、三唑磷、辛硫磷、多菌灵和水胺硫磷;从农药超标比率变化趋势来看,克百威、水胺硫磷、腐霉利、多菌灵属于下降型,氟虫氰、吡虫啉、氧乐果属于先升后降型,辛硫磷、三唑磷、毒死蜱属于先降后升型.同一蔬菜品种中容易超标的农药分别是:芹菜中毒死蜱、甲拌磷、克百威、辛硫磷易超标;韭菜中腐霉利、毒死蜱、克百威易超标;普通白菜中克百威、毒死蜱、多菌灵、涕灭威易超标;叶用莴苣中吡虫啉、啶虫脒、氧乐果易超标;茼蒿中克百威、毒死蜱、氯氰菊酯易超标.     

Establishment of T-lymphocytes that express CD20scFv-IgGFc-CD28-ζ and CD20scFv-IgGFc and their killing activity of B-lymphoma cells

AIM: To investigate the target killing effect of T lymphocytes with chimeric CD20scFv gene on Daudi cells and the activation of T lymphocytes. METHODS: Two kinds of plasmids were transfected into retrovirus-packed PA317 cell lines. The supernatant was collected from successfully transfected PA317 culture and was used to infect peripheral blood T lymphocytes. After one-week screening with G418, the cells were used to kill Daudi and K562 cells. The positive rates of AnnexinⅤ in Daudi cells were measured at different times points respectively by flow cytometry. Meanwhile, the level of IL-2 and IFN-γ were determined by ELISA. RESULTS: The Annexin V positive rate was significant higher in Daudi cells compared to control K562 cell lines at 24 h. No difference of AnnexinV in Daudi cells was observed in CD20 modification T lymphocyte groups. The secretions of IL-2 and IFN-γ in CD20scFv-CD80-IgGFc-CD28-ζ gene modified T cells co-cultured with Daudi cells were dramatically higher than that in CD20scFv-IgGFc group at 72 h. CONCLUSION: ① The two kinds of genetic modified specific T cells have no significant difference in inducing early apoptosis of Daudi cells. CD28-ζ cant affect Daudi cell early apoptosis at the CD20scFv target killing. ② The increase in the secretions of IL-2 and IFN-γ is more obvious in CD20scFv-IgGFc-CD28-ζ group, indicating that the self-activation takes place in CD3ζ and CD28 modified T cells without MHC restriction and then increases the activation and killing function of T cells.     

树干注射呋喃丹防治合欢蔷薇窄吉丁试验研究

为明确呋喃丹做为树干注射药剂对合欢蔷薇窄吉丁的防治效果,2008年在河北省隆尧县城进行试验。结果表明:用76%呋喃丹原粉水溶液进行树干注射,对合欢蔷薇窄吉丁虫具有较好的防治效果,生产上建议使用剂量为每孔7.5mL,在5月上旬使用,对幼虫和成虫均有良好的防治效果。     

呋喃丹特性及生物降解研究进展

呋喃丹作为高毒、高残留的氨基甲酸酯类农药,具有高效、广谱。但是呋喃丹施入土壤后大量残留在水体、土壤及生物体中,直接威胁人类的生存环境。现对呋喃丹生理生态学特性及其在土壤中的生物降解进行了概述,为农药生物降解和土壤污染物的修复提供参考。     

福戈水分散粒剂防治甘蔗害虫多点试验

多点试验结果表明,在甘蔗大培土时667m2用40%福戈水分散粒剂40g与肥料混合1次施于蔗根,可有效防治甘蔗蚜虫、蓟马、螟虫、金龟子等主要甘蔗害虫。与对照（呋喃丹）相比,对金龟子、黄螟蛀根、螟虫蛀茎、螟虫蛀节、蓟马和蚜虫的防治效果,分别达到了36.1%、75.0%、63.8%、78.8%、96.1%和100%。     

基于分子检测技术的番茄和茄子嫁接番茄砧木培育方法

摘要：为了获得能够同时作为番茄和茄子嫁接的砧木，选用自主培育的多抗番茄砧木组合26个，国内优良番茄嫁接砧木品种4个和国外引进番茄嫁接砧木3个，分别进行抗病基因包括抗根结线虫的Mi1和Mi-2、抗颈腐根腐的Frl、抗枯萎病的I-2/5和抗黄萎病的Ve1基因的分子标记检测；同时还测定了砧木品种根、茎的主要生理指标，包括壮苗指数（茎粗/株高）、根系质量和下胚轴长度等。结果表明：番茄砧木嫁接试验中，番茄接穗的嫁接成活率和移栽成活率均在95.0%以上，茄子接穗的嫁接成活率和移栽成活率均在85.0%以上。筛选出的HC483、HC484、HC490、HC493、HC494、HC495、500-2、B2和Y1共9个砧木品种综合表现较为突出，而且以这些番茄砧木培育得到的种苗长势旺盛、根系发达且抗多种病虫害。     

酶抑制法检测蔬菜农药残留的效果评价

采用色谱定量检测验证方法,对目前常用的酶抑制法速测蔬菜中农药残留的效果进行 了评
价。结果表明：酶抑制法检测不同农药灵敏度差异较大,其中以克百威的灵敏度最好,最低可达0.003
mg·kg-1,其次为灭多威和甲萘威。但对于目前蔬菜中常检出的毒死蜱和三唑磷等灵敏度不高。速测因最
低检测限高和基质干扰的影响,部分结果存在假阳性和假阴性风险,蔬菜产品假阳性率为7.1%～26.2%,
而以毒死蜱为试验农药的蔬菜样品检测假阴性率较高。因此,酶抑制法速测在蔬菜高毒快速控制上发挥了
一定作用,但作为执法检测需进一步研究前处理提取方法和提高 酶试剂质量。     

QuEChERS法动态监测及评价山西省韭菜中12种农药残留

采用乙腈超声提取,经PSA、C_(18)基质分散净化,通过液质联用及气质联用建立了韭菜中吡虫啉、敌敌畏、毒死蜱、多菌灵、腐霉利、甲胺磷、甲氰菊酯、克百威、六六六、氯丹、(高效)氯氟氰菊酯、阿维菌素等12种农药的Qu ECh ERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)快速检测方法,并对山西省市售韭菜的农药残留状况进行了动态监测和评价。结果表明:山西省韭菜中农药残留的总检出率为80%,超标率为20%,使用比较多的农药为吡虫啉、敌敌畏、多菌灵、腐霉利、甲氰菊酯和(高效)氯氟氰菊酯,腐霉利超标是韭菜产品不合格的主要因素。8月后太原及周边地区韭菜中的农药残留水平较高,且该地区农贸市场与超市韭菜中农药残留的检出率相近,但前者超标率(27.3%)明显高于后者(9.1%)。