p53在哺乳动物胚胎着床和分娩中的作用

近年来研究发现,p53家族成员在哺乳动物生殖过程中发挥重要的作用。本文对p53在哺乳动物胚胎着床和分娩中的作用及分子机制进行了全面的综述。     

大鼠品系PGR-iCre构建

采用CRISPR/Cas9基因编辑技术首次制备用于子宫基因敲除的PGR-iCre大鼠。PGR-iCre大鼠与含有Flox报告基因Tdtomato大鼠(Tdtomatof/f)杂交得到PGRCre+/--Tdtomatof/+大鼠。利用real-time PCR、免疫组化、荧光检测等技术检测Tdtomato基因在PGRCre+/--Tdtomatof/+大鼠不同器官表达,间接检测PGR驱动的Cre重组酶组织特异性表达。结果表明,PGR驱动Cre重组酶在大鼠子宫、卵巢、输卵管、乳腺、下丘脑、垂体、脾脏、肾脏、肺等器官不同程度表达;未检测到Cre重组酶在心脏、肝脏、肌肉中表达。综上,PGR-iCre大鼠可作为子宫基因敲除工具鼠研究大鼠子宫表达基因的相关功能。     

SerpinB6b在大鼠着床期子宫及蜕膜的表达与调控

SerpinB6b是丝氨酸蛋白酶抑制剂亚家族B成员之一。本实验旨在利用荧光定量PCR、原位杂交、免疫组织化学与蛋白质印迹分析等实验技术,研究SerpinB6b mRNA和蛋白在大鼠早期妊娠1~9 d、人工诱导蜕膜化及体外诱导蜕膜化模型子宫中的表达规律。结果显示:SerpinB6b mRNA和蛋白在大鼠早期妊娠1~5 d腔上皮、腺上皮有微弱表达;在6~9 d,表达主要集中在胚胎和蜕膜区,且随蜕膜化程度增加,表达量逐渐增强,且在第8天达到最高;在大鼠人工诱导蜕膜化模型中,SerpinB6b在蜕膜区的表达均显著高于非蜕膜区;在大鼠子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化模型中,SerpinB6b随着诱导蜕膜化天数的增加呈上升趋势。以上体内和体外实验结果表明,SerpinB6b在大鼠子宫中的表达具有着床相关特异性,SerpinB6b参与大鼠子宫蜕膜化过程。     

条件性子宫细胞剔除的研究

为了研究体内细胞的功能和各种细胞之间的相互作用,试验研究了可以特异性消除特定细胞的条件性细胞剔除新方法。通过PR^Cre/+工具鼠与pCAG-loxp-STOP-loxp-DTR-2A-EGFP转基因小鼠（DTR小鼠）交配获得子宫特异表达白喉毒素受体（DTR）的转基因小鼠,经过PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定基因后,筛选出PR^Cre/+/pCAG-loxp-STOP-loxp-DTR-2A-EGFP雌性小鼠（PR-DTR小鼠）。以DTR小鼠和野生型小鼠（WT小鼠）作为试验对照组,利用免疫组织化学和Western blotting检测子宫中绿色荧光蛋白（GFP）的表达。腹腔注射白喉毒素1 ng/d,连续2 d,观察PR-DTR小鼠、DTR小鼠和WT小鼠子宫的外部形态差异,并通过HE染色的方法观察子宫的内部形态。使用免疫组织化学方法检测注射白喉毒素后PR-DTR小鼠、DTR小鼠和WT小鼠子宫中叉头框蛋白A2（FOXA2）的表达。试验发现在小鼠子宫上皮、基质和肌层细胞中都有GFP的表达,注射白喉毒素后PR-DTR小鼠子宫红肿膨胀,DTR小鼠和WT小鼠子宫没有显著变化。HE染色试验结果发现,PR-DTR小鼠子宫中出现异常空腔,而DTR小鼠和WT小鼠子宫没有明显变化,并且对注射白喉毒素的PR-DTR小鼠子宫中FOXA2表达的检测结果表明,这些异常的空腔不属于腺体,说明白喉毒素使细胞死亡,证实在小鼠子宫中表达孕酮受体的细胞表达了DTR。试验结果表明,白喉毒素在PR-DTR小鼠子宫中可以条件性剔除子宫中表达孕酮受体的细胞,为研究子宫细胞的功能以及子宫细胞相互之间的作用提供了新方法。     

10种血清型腺相关病毒在哺乳动物子宫原代细胞中的转导

为探究10种血清型腺相关病毒(AVV)在哺乳动物子宫原代细胞中的转导情况并筛选出转导效率高的血清型，通过酶消化法获取哺乳动物子宫上皮和基质细胞、Real-Time PCR测定病毒滴度以及荧光显微镜观察和Western blot技术探究其转导效率。结果显示，10种血清型在小鼠子宫上皮细胞中，AAV-DJ可转导；在小鼠子宫基质细胞中的转导效率为AAV-DJ>AAV1、AAV2、AAV5>AAV9。在兔子宫上皮细胞中的转导效率为AAV5、AAV-DJ>AAV2>AAV9;在兔子宫基质细胞中的转导效率为AAV-DJ>AAV1、AAV2、AAV5>AAV9。在猪子宫上皮和基质细胞中的转导效率为AAV-DJ>AAV2、AAV5>AAV1。在人子宫基质细胞系中的转导效率为AAV-DJ>AAV2、AAV9>AAV1、AAV3>AAV8。综上所述，在转导哺乳动物子宫上皮细胞时，AAV-DJ、AAV5和AAV2效果较好；在转导哺乳动物子宫基质细胞时，AAV-DJ、AAV2、AAV9、AAV5、AAV1效果较好。     

Tdo2在大鼠围着床期子宫中的表达规律研究

深入研究哺乳动物胚胎着床的分子机理对提高动物繁殖率具有重要意义。本文以大鼠为动物模型,利用原位杂交技术研究了Tdo2基因在大鼠围着床期的表达规律,探讨了Tdo2基因在大鼠胚胎着床过程中可能发挥的作用。     

Elastin基因在小鼠早期妊娠过程中的表达

弹性蛋白(Elastin)是一种关键的细胞外基质蛋白,对大动脉、肺、韧带、肌腱、皮肤和弹性软骨等许多脊椎动物组织的弹性和复原力至关重要。本实验旨在利用原位杂交、荧光定量PCR方法,研究Elastin mRNA在小鼠早期妊娠、假孕及人工诱导蜕膜化模型子宫中的表达。结果显示:在小鼠早期妊娠1~4d子宫中未检测到ElastinmRNA表达;随着妊娠进行,在妊娠第5天子宫肌层检测到ElastinmRNA微弱表达;在妊娠第6天的子宫壁肌层与第7、8天的肌层及蜕膜区Elastin mRNA表达逐渐增强。在小鼠假孕1~5 d子宫中,ElastinmRNA不表达。在人工诱导蜕膜化模型中,ElastinmRNA在子宫壁肌层及系膜侧蜕膜区均有表达。以上表明Elastin可能参与小鼠早期妊娠子宫壁肌层弹性的调控与蜕膜化过程。