鸭坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒二重PCR检测方法的建立

参考Gen Bank上已发表的鸭坦布苏病毒(DTMUV)NS5基因序列和产蛋下降综合征病毒(EDSV)五邻体(penton)基因序列,分别设计了检测DTMUV和EDSV的特异性引物,扩增目的片段大小分别为242 bp和181 bp。通过退火温度及引物浓度的优化,建立了针对这两种病毒的二重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法可以同时检测DTMUV和EDSV,且不与鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、番鸭呼肠孤病毒、小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒以及大肠杆菌的核酸发生交叉反应;敏感性试验表明,该方法对DTMUV的最低检出限为590个拷贝,对EDSV的最低检出限为3 260个拷贝;该方法重复性良好,对不同批次的样品扩增效果良好。通过检测两种病毒感染的阳性病料各10份,结果显示,该二重PCR检测方法对阳性样品的检出率可达100%。这表明该方法可以用于鸭坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒的检测。     

检测鸭坦布苏病毒NS1抗体ELISA方法的建立

为了检测鸭群中鸭坦布苏病毒的血清学流行情况,本研究在前期成功表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的基础上,建立了检测鸭血清中鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法。棋盘法确定了当纯化的NS1蛋白包被量为0.188μg/孔,待检血清1:200稀释,HRP标记的兔抗鸭二抗1:16000倍稀释时反应条件最佳。在最佳反应条件下,阴阳性临界值判定标准为0.467。用建立的间接ELISA方法对番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭肝炎病毒、鸭疫里默氏杆菌阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为6%和10%,显示该方法具有很好的稳定性。用建立的ELISA方法检测临床鸭坦布苏病毒感染鸭及攻毒蛋鸭的55份临床血清样品,测得52份为阳性,阳性率为94.5%,对36份阴性鸭群血清样品进行检测,36份为阴性,阴性率为100%。该方法为鸭坦布苏病毒的诊断和流行病学监测奠定了基础。     

家禽视黄酸诱导基因-Ⅰ研究进展

天然免疫是机体抵抗病原微生物的第一道防线,视黄酸诱导基因-Ⅰ(RIG-Ⅰ)是细胞质内识别病毒双链RNA的一类模式识别受体,能够识别细胞质中的病毒RNA,诱导宿主细胞产生Ⅰ型干扰素等细胞因子,进而产生相应的抗病毒天然免疫反应。目前对人、小鼠、猪等哺乳动物细胞中RIG-Ⅰ介导的抗病毒天然免疫反应的研究较为深入,对家禽RIG-Ⅰ的相关研究还处于起步阶段。近年来,鸭和鹅的RIG-Ⅰ相继被研究。鸭和鹅RIG-Ⅰ的发现、结构特点、组织表达及其抗流感病毒和其他禽类病毒作用方面的研究都有了新的进展,将为禽类抗病毒和免疫系统研究提供参考。     

鹅细小病毒NS1蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

本研究克隆了鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)佛山株(Foshan-2009)的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体p ET32a(+),构建重组质粒p ET32a-NS1。经转化,IPTG诱导表达及SDS-PAGE和Western blot分析表明,NS1蛋白得到了表达,并且能与抗GPV的番鸭血清发生特异性反应。通过棋盘法确定NS1蛋白包被量为0.5μg/孔,待检血清1:50稀释,HRP标记的兔抗鸭二抗1:10 000倍稀释时ELISA反应条件最佳,并确定阴阳性临界值为0.399。该ELISA方法特异性强,与番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、新城疫病毒和鸭疫里默氏杆菌的阳性血清均无交叉反应;重复性好,批内和批间重复试验的变异系数分别小于5%和10%;检出率高,GPV阳性番鸭血清的检出率为92%。本研究所建立的间接ELISA方法为鹅细小病毒的血清学诊断和流行病学监测奠定了基础。     

番鸭细小病毒套式PCR检测方法的建立及应用

通过比对分析GenBank上登录的多株番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus,MDPV）和鹅细小病毒（Goose parvovirus）全基因序列,选取两种病毒间相似性较低的区域设计合成了2对特异性引物,建立了能快速鉴别诊断MDPV的套式PCR方法。该法仅能特异地扩增MDPV,敏感性达到62copies／uL,比普通PCR高1000倍。运用该方法对分离的12份临床样品进行检测,结果检测出2份MDPV。本试验所建立的套式PCR方法可用于MDPV感染的临床诊断和流行病学调查。