鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立

参考Gen Bank上已发表的产蛋下降综合征病毒(EDSV)五邻体(penton)基因序列、H9亚型禽流感病毒的HA基因和鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因序列,分别设计了检测EDSV、H9 AIV和DTMUV的特异性引物,扩增目的片段大小分别为110bp、281bp和266bp。通过PCR验证及引物浓度的优化,建立了针对这3种病毒的三重荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法可以同时检测EDSV、H9 AIV和DTMUV,且不与鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA以及鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒的RNA发生交叉反应;敏感性试验表明,该方法对EDSV、H9 AIV和DTMUV核酸的检测下限分别为8.0、4.8和1.3个拷贝,该方法比常规PCR方法敏感10倍;该方法重复性良好,对不同批次的样品扩增效果良好。通过标准曲线的建立以及临床样品的检测表明,该方法可以用于EDSV、H9 AIV和DTMUV的定性和定量检测。     

鸭坦布苏病毒RT-PCR检测方法的建立

为快速检测鸭坦布苏病毒(DTMUV),根据鸭坦布苏病毒E蛋白的基因序列设计一对特异性PCR引物,并以鸭坦布苏病毒基因组为模板,建立了鸭坦布苏病毒的特异性RT-PCR检测方法,进行了特异性和敏感性试验,并用该方法对采自江苏地区的疑似病料进行了检测。结果表明:该方法可以特异性地扩增出鸭坦布苏病毒E蛋白基因保守区514 bp的序列,和对照的其他鸭病毒无交叉反应;敏感性较好,最低可检测到1 fg的基因组;临床样品的检出率为100%。说明所建立的RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高,可用于临床快速诊断鸭坦布苏病毒。     

鸭坦布苏病毒与鸭圆环病毒二重RT-PCR方法的建立

为了研究一种可同时检测鸭坦布苏病毒与鸭圆环病毒的二重PCR方法,试验采用DNASTAR及Primer Premier 5.0软件,针对Gen Bank中坦布苏病毒(DTMUV)E基因和鸭圆环病毒(Du CV)REP基因的保守序列,设计合成了2对引物,通过优化反应体系条件及特异性、敏感性评价,建立了鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的二重RT-PCR方法。结果表明:该方法对鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的检测敏感性达到100 fg;使用该方法对新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合征病毒的检测结果全为阴性。说明建立的二重RT-PCR检测方法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒感染的快速鉴别诊断。     

应用二重实时荧光定量RT-PCR鉴别坦布苏病毒与产蛋下降综合征病毒

为更加快速敏感地对两种导致产蛋下降的禽类病毒:坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒进行鉴别,试验建立了一套二重实时荧光定量RT-PCR方法。通过针对两种病毒的特异保守序列,设计两套引物和探针,分别标记不同的荧光基团和淬灭基团,并优化反应体系。结果显示:建立的二重实时荧光定量RT-PCR方法只扩增这两种病毒的目的片段,无交叉扩增反应,与其他常见禽类病原体也无扩增反应;该检测体系最低可同时检测100个拷贝的坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒,比常规PCR和RT-PCR敏感10~100倍;检测30份样品,共检出7份EDSV阳性,6份TMUV阳性,与病毒分离结果符合。表明建立的二重实时荧光定量RT-PCR方法可以快速、敏感、特异地鉴别诊断坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒。     

一例樱桃谷种鸭坦布苏病毒病与呼肠孤病毒病混合感染的诊断

江西省赣州地区某种鸭场樱桃谷种鸭发生一起以产蛋下降、个别死亡、卵泡出血和肝脏、脾脏表面有白色坏死点为主要特征的疫病,我们设计特异性引物并以建立的PCR、RT-PCR方法对该病例样品分别进行了禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、禽多杀性巴氏杆菌、鸭呼肠孤病毒、产蛋下降综合征病毒、副粘病毒和鸭瘟病毒的检测,结果仅扩增出约330 bp大小的鸭坦布苏病毒特异性条带和约680 bp大小的鸭呼肠孤病毒特异性条带,结合临床剖检病变和实验室检测结果,确诊该病例为鸭坦布苏病毒病与呼肠孤病毒病合感染。     

鸭坦布苏病毒病RT-PCR检测方法的建立

鸭坦布苏病毒病是近年来新发的危害养鸭业较严重的传染病之一。自2019年疑似病例在云南发生以来,给云南养鸭业造成严重损失。针对鸭坦布苏病毒(DTMUV)保守的非结构蛋白NS5基因序列,设计1对引物,建立DTMUV的RT-PCR检测方法。该方法特异性地扩增出718 bp,检测的敏感度为3.24 pg/μL;对鸭肝炎病毒、新城疫病毒、禽腺病毒、减蛋综合征病毒和禽流感病毒均无扩增条带;应用建立的RT-PCR方法检测临床疑似病料,阳性结果经测序证明感染DTMUV。为鸭坦布苏病毒病的病原检测提供了一种快速方法。     

鸭坦布苏病毒RT-PCR诊断方法的建立与应用

为建立一种快速的鸭坦布苏病毒病原检测方法,本研究根据GenBank上登录的鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)基因组序列,设计1对引物,建立了检测DTMUV的RT-PCR诊断方法。该方法对Ⅰ型鸭肝炎病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、鸭肠炎病毒等常见鸭病的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1 ng RNA。该RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确快速检测出极低含量的DTMUV,将为DTMUV的病原检测及分子流行病学调查等提供一种快速、灵敏、特异、准确的分子生物学检测方法。     

H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种能同时快速检测H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)的二重PCR检测方法。根据GenBank中H9亚型 AIV的HA基因和DTMUV的NS2基因序列,分别设计了1对针对H9亚型AIV和DTMUV保守基因序列的引物。利用这2对引物对混有H9亚型AIV和DTMUV的cDNA模板进行二重PCR扩增,得到了2个大小与试验设计相符的特异性扩增条带。利用本试验建立的二重PCR对其他鸭病病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。利用这2对引物对H9亚型AIV和DTMUV进行敏感性检测,结果显示最低检测极限分别为6.3和 6.6 pg。对临床235份样品检测的结果表明该二重PCR检测方法具有快速、敏感、特异等优点,适用于临床检测的应用。     

应用PCR技术检测鸡产蛋下降综合征病毒

根据已发表的鸡产蛋下降综合征病毒(egg drop syndrome virus,EDSV)基因序列设计特异性引物,目的基因片段大小为273 bp,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对EDSV进行扩增。结果表明,该方法对EDSV标准株扩增为阳性,对鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病毒及肾型传染性支气管炎病毒的扩增结果均为阴性。应用PCR技术对试验样品进行检测,均能够扩增出预期的DNA片段。由此可以得出,PCR技术可以用于鸡产蛋下降综合征病毒的检测。     

鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒及番鸭呼肠孤病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与临床应用

为建立鉴别检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)、新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)及番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的方法,本研究分别针对DTMUV E基因与NDRV、MDRV S3基因,设计特异性引物和Taq Man探针,经优化反应条件,建立了同一体系中同时检测DTMUV、NDRV及MDRV的Taq Man荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅能扩增DTMUV、NDRV及MDRV,与禽呼肠孤病毒(ARV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、鸭瘟病毒(DEV)等主要禽源病毒均无交叉反应,特异性强;对DTMUV、NDRV及MDRV质粒标准品的检测下限均为7.5×10~1拷贝/μL,敏感性高;组内与组间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性好。利用该方法与已报道的坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法及NDRV与MDRV双重RTPCR方法同时检测82份临床疑似患病鸭的肝脾组织样品,结果检出阳性样品22份,其中,DTMUV阳性检出率为10.98%(9/82),NDRV阳性检出率为2.44%(2/82),MDRV阳性检出率为13.41%(11/82),检出阴性样品60份。与参考方法的检测结果一致,三者的符合率达100%。本研究建立的方法为临床DTMUV、NDRV及MDRV鉴别检测和流行病学调查提供了特异、敏感、高效的技术支撑。     

番鸭细小病毒与鸭圆环病毒二重PCR方法的建立

根据基因库中鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的基因序列,分别设计了两对特异性引物,通过对二重PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时鉴别检测鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的二重PCR方法。用该方法对同一样品中鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的模板进行PCR扩增,结果均得到了与实验设计相符的351bp（鸭圆环病毒）和474bp（番鸭细小病毒）的扩增条带,而对鸭Ⅰ型肝炎病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。敏感性测定结果表明：该二重PCR技术最低能检出100fg的鸭圆环病毒和番鸭细小病毒DNA模板。研究建立的鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的二重PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭圆环病毒和番鸭细小病毒感染的检测。     

鹅细小病毒、番鸭细小病毒及鸭圆环病毒多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与临床应用

为建立鉴别检测鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)及鸭圆环病毒(DuCV)的方法，本研究分别针对GPV、MDPV NS基因与Du CV Rep基因，设计特异性引物和Taq Man探针，经优化反应条件，建立了同一体系中同时鉴别检测GPV、MDPV及Du CV的Taq Man荧光定量PCR方法。利用该方法检测GPV、MDPV、Du CV及禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、减蛋综合征病毒、鸭坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒等主要水禽源病毒，结果显示，该方法仅能扩增出GPV、MDPV及Du CV，与其他主要水禽源病毒均无交叉反应，特异性强；利用该方法检测等体积混合后的GPV、MDPV及Du CV质粒标准品混合物，结果显示，该方法对3种质粒标准品的检测限均为7.5×10¹拷贝/μL，普通单一PCR对上述3种质粒标准品混合物的检测限均为7.5×10³拷贝/μL，表明本研究建立方法的敏感性高于普通PCR；该方法组内与组间重复性试验的变异系数均小于2.0%，重复性好。利用该方法与MDPV和GPV双重荧光定量PCR方法及Du CV荧光定量PCR方法同时检测...     

鸭疫里氏杆菌与鸭坦布苏病毒双重PCR方法的建立

为建立一种能同时快速检测鸭疫里氏杆菌(RA)和鸭坦布苏病毒(DTMUV)的PCR方法,根据NCBI公布的RA dnaB基因和DTMUV PrM基因分别设计并合成两对特异性引物,通过对双重PCR反应的引物浓度和退火温度进行优化筛选。优化引物浓度组合为:RA引物0.5μmol/L,DTMUV引物为1μmol/L,最佳退火温度为53℃。特异性试验表明,该方法对鹅细小病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、番鸭细小病毒、I型鸭肝炎病毒、沙门氏菌、大肠杆菌的核酸扩增结果均为阴性,RA和DTMUV的检测结果为阳性。敏感性测定表明,该双重PCR方法最低能检出RA和DNAV-1的核酸量分别为6.7 pg和3.6 pg。本研究建立的检测方法检测实验室保存的8份临床病料,RA的阳性率为62.5%,DTMUV阳性率为37.5%。综上所述,建立的PCR方法特异性强、敏感性和稳定性良好,为RA和DTMUV的临床病料检测提供了技术支撑。     

鸭甲肝病毒与新型呼肠孤病毒复合RT-PCR检测方法的建立

根据鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)的3D基因序列和新型鸭呼肠孤病毒(Novel Duck reovirus,NDRV)的S3基因序列,分别设计了1对特异性引物,通过条件优化建立了鉴别DHAV和NDRV的复合RT-PCR方法。该方法对DHAV和NDRV的最低检出量均为100 copies,而对番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)、鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)、鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)和鸭副粘病毒(Duck paramyxo virus,NDV)的检测结果均为阴性。临床样品的检测结果显示,该方法是一种快速鉴别诊断DHAV和NDRV感染的有效手段。     

鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种同时快速检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)和所有亚型禽流感病毒(AIV),且可同时进行H9亚型AIV分型检测的多重PCR检测方法。针对Gen Bank中DTMUV NS2基因、所有亚型AIV的M基因和H9亚型AIV的HA基因的保守序列,分别设计了3对特异性引物,建立了DTMUV和AIV多重PCR检测方法。该方法对混有H9亚型AIV和DTMUV的模板进行PCR扩增,得到了3个大小与试验设计相符的特异性扩增条带,对其他鸭病病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该方法能检测到45 pg的DTMUV、7.6 pg的H9亚型AIV和76 pg的M基因。研究建立的多重PCR检测方法,具有快速、敏感、特异等优点,适用于临床检测的应用。     

鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据鸭坦布苏病毒(DTMUV)BYD-1株基因序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立了快速检测DTMUV的实时荧光定量RT-PCR方法。特异性结果显示,DTMUV显示阳性,而3株非鸭坦布苏病毒均显示阴性,说明该方法具有高度特异性。其表达式为Ct=-3.32×lg Copy number+41.151,R2=0.998,R循环效率Eff%=100.072,DNA拷贝数在101～108范围内检测曲线有良好的线性关系,对质粒标准品最低检测限为1.0×101拷贝/μL,变异系数低于5%。利用该方法分别对攻毒感染具有典型鸭新型黄病毒病临床症状和病理变化的蛋鸭的脾脏和肝脏组织进行检测,阳性率均为100%,而用本实验室建立的普通RT-PCR方法检测的阳性检测率为85%(17/20)和75%(15/20)。建立的方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强的特点,可用DTMUV早期感染的快速诊断和流行病学调查。     

应用降落PCR检测减蛋综合征病毒的研究

根据已发表的减蛋综合征病毒(EDSV)核苷酸序列设计了1对扩增长度为1．1kb左右的引物，采取降落PCR对EDSV-gDNA进行扩增。结果，从2份EDSV鸭胚尿囊液、3份人工感染鸡输卵管组织液的核酸抽提物中，均扩增出与设计大小完全一致的目的片段，而对照样品的扩增均为阴性，该方法最低可检测到32Pg的EDSV-gDNA。表明该降落PCR用于检测EDSV特异性和敏感性均较强，可用于减蛋综合征的诊断。     

二重PCR检测鸭瘟病毒和鹅细小病毒的初步研究

根据鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)DNA聚合酶基因和鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)NS基因序列分别设计2对引物,应用这2对引物对混合样品中鸭瘟病毒和鹅细小病毒进行了二重PCR扩增。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明2条特异性带为563bp(DPV)和1146bp(GPV),与实验设计相符,且与常规单一PCR结果一致。二重PCR反应检测出的DPV含量相当于20个PFU;检测出的GPV含量相当于0.1个ELD50,对禽痘病毒和减蛋综合征病毒的核酸未能扩增出任何条带,特异性良好。该二重PCR能够在一次扩增反应中检测两种病毒,为两种鹅病的病原检测和诊断提供了一种简便、经济、快速的手段。     

鸭坦布苏病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量检测方法的建立

根据鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DFV) NS5基因序列特征设计引物,建立基于SYBR Green Ⅰ检测模式的实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR,RRT-PCR),该方法检测DFV NS5基因2.74×103～2.74×10 7拷贝/μL反应范围内有很好的线性关系.扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(86.23±0.18)℃,对禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭源禽1型副黏病毒、鸭减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.52％～1.48％,组间变异系数0.71％～2.21％.检测速度快,从样本处理到报告结果仅需4h.     

应用套式RT-PCR快速检测鸭坦布苏病毒

鸭坦布苏病毒是新发现的一种可引起鸭产蛋下降、生长迟缓和死亡的黄病毒。目前尚无可靠的快速诊断方法用于该病毒的检测。本研究根据鸭坦布苏病毒E基因序列,设计了2对重叠引物P1、P2和P3、P4,建立了检测鸭坦布苏病毒的套式RT-PCR方法,该套式RT-PCR比一般PCR敏感性高10倍。采用该方法对安徽省、河北省、山东省、浙江省、上海市等地发病鸭场的63份样品进行了检测,阳性检出率为48/63（76.2%）,而病毒分离率仅为13/63（20.6%）。由此表明,与其他方法相比较,本试验所建立的套式RT-PCR方法具有快速、敏感、特异优点,可用于鸭坦布苏病毒的流行病学调查及病毒的检测。