Flag-ALD融合载体构建及蛋白表达

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）是感染鱼类的最常见致病菌之一，为了解维氏气单胞菌中丙氨酸脱氢酶（alanine dehydrogenase，ALD，EC 1.4.1.1）的调控功能，笔者通过分子克隆获得 Flag-ALD 融合表达载体，并在大肠杆菌中大量表达该蛋白。即以维氏气单胞菌C4基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增获得N端带有Flag标签的ald基因，将带有标签的目的基因与原核表达载体pACYCDuet连接，并将重组质粒pACYCDuet-Flag-ald 转化到大肠杆菌（E.coli）BL21中。添加异丙基?β?D?1?硫代半乳糖吡喃糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导重组蛋白大量表达。SDS-PAGE分离与Western blot结果表明，来源于维氏气单胞菌的Flag-ALD重组蛋白在E.coli中以可溶性形式成功表达。本实验构建的Flag标记靶标蛋白可为研究丙氨酸脱氢酶在维氏气单胞菌中的功能以及在生物抑菌剂方面的应用提供技术支持。     

抑制尖孢镰刀菌人工肽适体的筛选和鉴定

香蕉枯萎病严重危害香蕉产业的发展。本研究从肽适体文库中筛选获得对香蕉枯萎病致病菌尖孢镰刀菌有抑制作用的人工肽适体SNP-D4。通过构建人工肽适体体外重组表达载体,获得SNP-D4体外重组蛋白。结果表明,通过抑菌活性检测表达人工肽适体SNP-D4的大肠杆菌全蛋白提取液,能够特异性抑制尖孢镰刀菌孢子的萌发,使其萌发率降低至19.60%。本研究筛选得到的人工肽适体SNP-D4可应用于研发环境友好型特异抗真菌生物制剂,为香蕉枯萎病防治提供新的技术手段。     

维氏气单胞菌flrB基因敲除株构建及其生物特性鉴定

维氏气单胞菌是一种常见的人鱼共患致病菌,为研究维氏气单胞菌中的flrB基因的功能,笔者通过扩增flrB基因上下游同源臂连接至pRE112质粒中,电击转化重组质粒至大肠杆菌WM3064,接合转入野生型维氏气单胞菌,在蔗糖压力下筛选、PCR和测序验证敲除菌株。结果表明,敲除flrB基因后降低生物膜的形成,但不影响维氏气单胞菌的生长。flrB基因能促进其生物膜的形成,这为进一步揭示该基因的功能和作用机制奠定了基础。     

用于研制柑橘DArT芯片的DNA探针文库的制备

以柑橘属Swingle分类系统界定的16种柑橘物种的基因组DNA为材料,构建了研制柑橘DArT芯片的DNA探针文库,进而从中随机挑选出15 000条探针用于柑橘DArT芯片的开发.柑橘物种的基因组DNA采用改良CTAB法提取并等量混合,经Eco RI和Mse I双酶切后连接接头序列,再使用选择性引物进行PCR扩增,并将扩增产物转化大肠杆菌,构建探针文库.从探针文库中随机挑选出15 000个阳性单克隆,通过PCR扩增和纯化获得了15 000条用于制备DArT芯片的DNA探针.凝胶电泳检测显示所制备的DNA探针的纯度和浓度均满足了研制DArT芯片的要求.为采用DArT芯片快速鉴定柑橘物种并研究其进化关系奠定了基础.     

高职高水平专业内涵建设策略研究

随着国家市场经济的发展,我国市场经济迎来了新的局面。总体表现为产业结构调整和技术升级,对于致力为国家市场经济提供相应人才的高职院校来说,要想抓住产业结构调整和技术升级的机遇,始终保障为企业提供一流的高素质人才,提高自己学校的核心竞争力,就要及时调整自己的人才培养政策,依据产业结构的调整方向和企业对人才的要求,改善自己的人才培养方案,科学合理的优化人才专业培养结构,不断强化高职专业内涵建设。     

维氏气单胞菌ΔexsA1减毒株对宿主免疫原性研究

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）是一种人鱼共患的革兰氏阴性病原菌。在革兰氏阴性菌中,ExsA能激活Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion systems, T3SS),对宿主产生毒害作用。前期分析基因组研究结果表明,维氏气单胞菌有2个拷贝的exsA基因,推测其毒力调控可能由exsA基因介导。利用同源重组双交换技术构建了维氏气单胞菌ΔexsA1敲除株,采用腹腔注射的方式进行攻毒实验,结果表明,exsA1缺失后维氏气单胞菌毒力显著下降。将ΔexsA1减毒株和野生株分别接种罗非鱼,发现鱼体内血清中免疫球蛋白M（IgM）积累水平上升,在第4天达到峰值;在致死剂量维氏气单胞菌野生株感染下,接种ΔexsA1减毒株对罗非鱼的免疫保护率为70%。ΔexsA1减毒株可为进一步开发维氏气单胞菌减毒活疫苗奠定基础。     

维氏气单胞菌Cbl蛋白的原核表达及纯化

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）引起的细菌性疾病已威胁到鱼类养殖业的发展。Cbl（类CysB蛋白）是细菌硫代谢的重要调控因子之一。本研究选取pET-28a为Cbl的原核表达载体,以大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌,使用IPTG（Isopropyl-beta-D-thiogalactoside,异丙基?β?D?硫代半乳糖苷）诱导表达,用SDS-PAGE凝胶电泳验证蛋白条带,再用BOSTER的BCA蛋白浓度测定试剂盒测量Cbl蛋白浓度,寻找较适宜的蛋白表达条件。结果表明,当诱导时间为8 h,IPTG终浓度为0.1 mmol·L?1,诱导温度为15 ℃,咪唑洗脱浓度为100 mmol·L?1时,Cbl蛋白质量浓度能达到601.405 mg·L?1,可满足后续实验要求。     

维氏气单胞菌的smpB、tmRNA及hfq敲除菌株减毒活疫苗筛选

为筛选维氏气单胞菌减毒活疫苗,为水产重要细菌性病害的防控提供新策略,本文通过荧光实时定量PCR检测三种敲除型菌株smpB、tmRNA及hfq中毒力相关基因表达;并采取腹腔注射法对尼罗罗非鱼进行野生型及三种敲除型感染,观察染病罗非鱼症状,计算累计死亡率及LD50。结果表明,维氏气单胞菌野生型与三种敲除型菌株相比,细菌毒力相关蛋白表达均呈现显著差异,部分毒力相关基因显著下调;三种敲除型菌株LD50分别增加1.24、5.32和19倍。由此可见,三种敲除型维氏气单胞菌可作为候选减毒疫苗,下调显著的hfq菌株是制备减毒疫苗的首选。     

植物萜类合成酶的进化研究

通过全面搜索和鉴定植物萜类合成酶基因家族的成员,我们重建了植物萜类合成酶的进化历史.研究发现 植物萜类合成酶的进化历史和植物谱系的分歧历史一致.低等植物地钱和苔藓的基因组只编码一个萜类合成酶. 从卷柏开始,萜类合成酶出现了基因重复和功能多样化,通过连续2次基因重复产生了3个萜类合成酶重复基因. 其中2个重复基因的功能发生亚功能化,共同行使原来的功能;而第三个重复基因则发生了新功能化,转变为催化 合成次生代谢萜类化合物,并且进一步分歧产生出萜类合成酶的其它4个亚家族.根据本研究构建的萜类合成酶 进化树,我们推断上述2次基因重复事件发生在卷柏和其它陆地植物分歧之前的祖先植物谱系中.     

变叶海棠物种复合体的分类界定和遗传分化初探

 在根据系统发育分析探明变叶海棠物种复合体6 个类群遗传来源的基础上,使用单拷贝核 基因SbeⅠ 进一步研究其分类界定和居群遗传分化。结果表明,SbeⅠ 基因的最大似然树由3 个大的进化枝 构成,物种界定分析将这3 个进化枝界定为3 个物种,但是变叶海棠物种复合体中的类群除花叶海棠外, 均不能被界定为物种。基于遗传距离和固定指数的遗传分化研究支持分类界定的结果。同一进化枝类群内 和类群间的遗传距离在分布范围上完全重叠（0 ~ 0.006）,并且小于不同进化枝类群间的遗传距离（0.008 ~ 0.016）。固定指数分析与遗传距离计算结果一致,表明同一进化枝中的类群彼此遗传分化很小,不支持将 其界定为物种。根据分类界定和遗传分化研究结果以及复合体类群的遗传来源,建议把多毛海棠作为变 叶海棠的变型处理,将马尔康海棠和小金海棠作为复合体的单个无融合生殖种处理。