从全长cDNA克隆恢复猪瘟病毒方法的研究

以携带猪瘟病毒Thiverval株全长cDNA克隆的pAC/F101/T1-7载体质粒为模板,在体外转录病毒基因组RNA,并转染PK-15和BHK-21细胞,通过传代、RT-PCR、免疫过氧化物酶细胞单层试验鉴定,成功地在两种细胞中拯救出具有感染性的病毒粒子。同时,通过2种细胞转染效率的对比试验,成功建立了利用高转染效率的其它真核细胞作为病毒拯救的过渡细胞,然后再在猪肾细胞系上进行增殖的病毒拯救方式,极大提高了猪瘟病毒拯救的效率。     

猪瘟病毒Thiverval株3′非编码区插入片段对病毒拯救的影响

猪瘟病毒（CSFV）疫苗株Thiverval株与亲本病毒Alfort株相比,最明显的区别就是其3′-UTR含有一定长度的插入序列。本研究通过反向遗传学操作,构建了3′-UTR含有19nt、32nt以及插入片段完全缺失的CSFVThiverval株全长cDNA感染性克隆,将突变病毒基因组进行体外转录,利用BHK-21细胞转染、PK-15细胞传代增殖的方式成功的从3种重组突变感染性克隆中拯救出活病毒粒子,表明CSFV疫苗株3′-UTR插入片段并不影响病毒的拯救。通过3′-UTR二级结构模拟,发现疫苗株的插入片段导致3′-UTR空间构型发生改变、自由能升高、影响二级结构的稳定性,可能是导致疫苗株毒力减弱的原因之一。     

细胞钙超载与鸡柔嫩艾美耳球虫病损伤关系

为探讨鸡柔嫩艾美耳球虫（E．tenella）宿主细胞损伤与钙超载的关系，采用组织定量检测、Von Kossa钙染色、焦锑酸钾电镜细胞化学技术对使用和未使用钙离子阻断剂的E．tenella感染鸡盲肠组织的细胞沉积钙、ATP酶、磷脂酶A2（PLA2）、游离脂肪酸和盲肠上皮细胞游离Ca^2＋的含量与分布进行了动态测定和分析。结果表明：（1）鸡患柔嫩艾美耳球虫病过程中，宿主细胞内钙和游离Ca^2＋明显增多（P〈0．01），并随盲肠损伤加重而增加；（2）在发病过程中盲肠组织Na^＋-K^＋-ATP酶、Ca^2＋-Mg^2＋-ATP酶、总ATP酶活性均有不同程度的下降，在感染严重期显著低于不感染对照组（P〈0．01）；（3）钙超载盲肠组织的PLA2活性和游离脂肪酸含量明显升高（P〈0．01），表明钙超载是鸡柔嫩艾美耳球虫病的一个重要损伤机制；（4）硝苯地平可以阻止Ca^2＋内流，减少宿主细胞内游离Ca^2＋，减轻宿主细胞的损伤，在本病发生的早期盲肠损伤较轻时，对鸡有一定的保护力，但随着疾病的发展，其作用下降。     

细胞钙信息转导与疾病发生发展的关系

在动物中提出环磷酸腺苷(cAMP)第二信使概念后,人们在研究中确认了另一种胞内信使--钙离子(Ca2 ),二者共同作用,调节机体的各种生命活动。本文从细胞信息转导途径入手,阐述了细胞信息转导过程中的各种调控因子及相关途径,并对一些疾病的发生发展和Ca2 信息转导的关系做出进一步的论述。     

细胞钙信息转导与疾病发生发展的关系

在动物中提出环磷酸腺苷(CAMP)第二信使概念后，人们在研究中确认了另一种胞内信使—钙离子(Ca^2 )，二者共同作用，调节机体的各种生命活动。本文从细胞信息转导途径入手，阐述了细胞信息转导过程中的各种调控因子及相关途径，并对一些疾病的发生发展和Ca^2 信息转导的关系做出进一步的论述。     

猪瘟病毒低温诱变疫苗Thiverval株感染性克隆的构建及病毒拯救

采用高保真DNA聚合酶,分7个片段扩增猪瘟病毒(CSFV)Thiverval株全基因组序列,克隆至pMD18-T载体并测序.经适当的连接策略将各片段连接克隆至低拷贝载体质粒pAC/F101,同时对病毒基因组5'和3'末端进行修饰,构建出含有T7启动子、榔头状(HH)核酶基因、CSFV Thiverval全基因组、丁型肝炎病毒(HDV)核酶基因和T7终止子的重组质粒pAC/F101/T1-7.利用T7 RNA聚合酶将线性化重组质粒pAC/F101/T1-7体外转录成基因组RNA,再使用脂质体转染将体外转录RNA转染PK-15细胞.通过传代、RT-PCR、免疫过氧化物酶细胞单层试验鉴定,表明成功的从感染性克隆拯救出活病毒粒子.猪瘟病毒低温诱变疫苗"Thiverval"株感染性克隆的构建及病毒的成功拯救,为进一步研究CSFV疫苗株的致弱机制提供了重要工具.     

猪瘟病毒Thiverval株3''非编码区插入片段对病毒拯救的影响

猪瘟病毒(CSFV)疫苗株Thiverval株与亲本病毒Alfort株相比,最明显的区别就是其3'-UTR含有一定长度的插入序列.本研究通过反向遗传学操作,构建了3'-UTR含有19 nt、32 nt以及插入片段完全缺失的CSFVThiverval株全长cDNA感染性克隆,将突变病毒基因组进行体外转录,利用BHK-21细胞转染、PK-15细胞传代增殖的方式成功的从3种重组突变感染性克隆中拯救出活病毒粒子,表明CSFV疫苗株3'-UTR插入片段并不影响病毒的拯救.通过3'-UTR二级结构模拟,发现疫苗株的插入片段导致3'-UTR空间构型发生改变、自由能升高、影响二级结构的稳定性,可能是导致疫苗株毒力减弱的原因之一.     

贵州省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异分析

为了调查猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异情况,笔者收集了贵州省16家规模化养殖场153份疑似PRRS的样品,通过RT-PCR检测和ORF5基因序列的测定,结果表明:所有样品之间ORF5基因的同源性为98.7%～100%,氨基酸的同源性为98.5%～100%;与美洲型代表毒株VR-2332、国内标准毒株CH-1a和欧洲型代表毒株LV基因序列的同源性分别为89.2%～90%、94.8%～95.6%、59.7%～60.2%,氨基酸序列同源性分别为88.8%～89.3%、92.7%～94.2%、54.9%～55.3%,遗传衍化关系分析表明流行毒株属于美洲型.ORF5基因发生离散性变异,可以分为3个簇,与中国其他地区分离的高致病性PRRS病毒关系密切,而与早期分离的PRRS毒株关系疏远,说明猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因存在变异现象.     

猪瘟病毒3′非编码区的多态性及其二级结构分析

【目的】分析CSFV3′-UTR一级序列和二级结构,为研究其对病毒复制、增殖和毒力的关系奠定良好的基础。【方法】利用RT-PCR技术扩增CSFV Thiverval株、HCLV株和Shimen株的3′-UTR并测序,使用DNAstar、Sequencher和RNAstructure软件进行CSFV3′-UTR基因组序列的比对分析和二级结构模拟。【结果】Thiverval株3′-UTR最长可达259个碱基,与母源株Alfort相比,含有32nt的插入,最短只有233个碱基,含有6nt的插入。HCLV株最长有244个碱基,含有17nt的插入;最短有233个碱基,含有8nt的插入。同时,疫苗株的插入片段导致3′-UTR空间构型和自由能发生改变,自由能随着插入片段的增加而升高。【结论】(1)CSFV3′-UTR存在两个高度变异的区域。(2)CSFV疫苗株Thiverval株和HCLV株3′-UTR同一样品不同克隆株中插入片段呈现明显的不均一。(3)疫苗株的插入片段影响3′-UTR二级结构的稳定性,可能是导致疫苗株毒力减弱的原因之一。     

兔球虫病的发生及其防治

兔球虫病是家兔常见的一种流行性疾病,是由艾美耳属的多种球虫寄生于肝胆管及肠上皮细胞而引起的一种兔寄生虫病。各种品种的家兔都有易感性,4￣5月龄内的幼兔对球虫的抵抗力很弱,其感染率高达100%,患病后的幼兔死亡率可达40%￣70%,耐过的病兔长期不能康复,生长发育受到严重影响,给养兔业造成巨大的经济损失。成年兔多为亚临床型或带虫者,主要症状表现为虚弱、消瘦、贫血、腹泻等,幼兔发育受阻,甚至死亡。由于球虫的种类和寄生部位的不同,可以分为肝球虫病和肠球虫病,但混合感染最为常见。1病原兔球虫属原生动物门,孢子虫纲,真球虫目,艾美耳…