凡纳滨对虾微卫星DNA的筛选及其特性的研究

采用小片段克隆法构建凡纳滨对虾的部分基因文库，用放射性同位素[y-^12P]ATP标记的（CA）15（AT）12（AG）12、（AAT）8、（AAG）8做探针筛选阳性克隆。共获得微卫星序列152个，其中二核苷酸为核心的微卫星序列：（AG）a〉（AC）a〉（AT）a，三核苷酸为核心的微卫星序列：（AAT）a〉（CAT）a〉（AAG）a应用引物设计软件primer3．0设计引物105对。选择合成10对理论上易出现影子带的引物，筛选后用31个凡纳滨对虾个体对这些引物进行了评估，结果10对引物中有8对引物能扩增出谱带，其中1对扩增产物出现影子带，1对扩增产物为单态．有6对扩增产物出现多态。     

磁珠富集法制备大口鲶的微卫星分子标记

2004年3月16日-6月8日，在广东广远渔业集团有限公司玻璃钢大滚筒冷海水金枪鱼延绳钓渔船“华远渔19”号，对印度洋马尔代夫海域进行金枪鱼渔业调查。所获数据资料包括：①CTD测定的温度、盐度和深度数据，TDR测定的实际钩深；②作业参数，包括每次作业的钩数、投绳位置、投绳时间、航向、航速、出绳速度、两浮子间的钩数、起绳位置、起绳时间等；③渔场环境数据，包括风速、风向、钓具对地漂移速度和方向；④渔获统计，包括大眼金枪鱼的渔获尾数以及部分大眼金枪鱼的钓获钩号；⑤生物学数据，包括起捕时已死的大眼金枪鱼的体温。分析计算的方法和步骤为：①由理论公式推算出每次作业时各钩号的理论深度；②应用逐步回归的方法，建立理论钩深与实测的平均钩深之间的数学关系模型；③根据实际平均钩深模型计算出每个钓钩的平均作业深度；④根据CTD测得的作业地点的温度、盐度的垂直分布（41次），获得分布曲线。由此，以计算的钩深，从曲线上查出该尾鱼捕获水深处的温、盐数据；⑤根据121尾大眼金枪鱼的取样数据，推算出各水层、水温段、盐度段的渔获率；⑥根据起捕时已死的34尾大眼金枪鱼（鱼体发硬）的体温、以死鱼体温为引数，在曲线上查出该尾鱼捕获水深和盐度；最后，对钓获的大眼金枪鱼的钓获水层、水温和盐度进行了总体分析。分析结果表明：在马尔代夫海域，捕获大眼金枪鱼的水层为50～210m、水温范围为13．0～29．9℃、盐度范围为35．00～35．79；渔获率最高的水层为70～90m、水温范围为27．0～27．9oC、盐度范围为35．70～35．79；捕获时已死鱼的捕获水层、水温和盐度推算数据为63～203m、14．0～27．0℃和34．94～35．42，主要集中在63～134m、16．0～27．0℃和35．30～35．42。     

雌核发育草鱼的遗传结构分析和微卫星鉴别方法的建立

采用微卫星标记检测草鱼群体的遗传多样性,并根据纯合度的变化建立了雌核发育草鱼的鉴别技术。结果显示,8个位点共扩增出33个等位基因;在普通草鱼中,平均纯合度和PIC分别为0.203 1和0.552 8;在雌核发育群体中,则为0.716 1和0.357 2;2个群体间遗传相似度为0.873 3。其中,5个位点在雌核发育草鱼中纯合度明显提高,雌核发育草鱼在这5个位点的扩增总条带数为5~7个,普通草鱼则为8~10个,由此可100%区分2个草鱼群体。通过概率计算,理论鉴别概率达到99.92%。研究表明,雌核发育技术对草鱼的群体遗传结构改变较大,是快速建立纯系、固定优良性状的有效手段;根据群体遗传纯合度的改变、扩增条带数目差异,应用多态性微卫星分子标记可以简单、有效地区分雌核发育群体(或与之相似的高度近交群体)与普通群体。     

草鱼的微卫星亲权鉴定

[目的]从亲权排除率、鉴别准确率、鉴别成功率等方面评价微卫星标记鉴别草鱼亲权关系的可行性,为草鱼系谱信息的确定奠定基础.[方法]利用8个微卫星标记检测5个草鱼家系亲本(F.)及其子代(F1)的基因型,以Cervus 3.0软件进行亲权鉴定,并统计微卫星位点的等位基因数(Na)、多态信息含量(PIC)、观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)等;最后通过模拟分析和试验验证,评估8个微卫星位点最多可鉴定的亲本数及其与鉴定率、置信度之间的关系.[结果]8个微卫星位点中,当两个亲本基因型未知时,单个亲本排除率(E-1P)介于0.342~0.668,平均值为0.520;当一个亲本基因型已知时,另一个亲本的排除率(E-2P)介于0.521~0.802,平均值为0.681;一对亲本组合的亲权排除率(E-PP)介于0.711~0.937,平均值为0.847.以95%置信水平和100%鉴定率为标准,模拟分析及试验验证结果表明,所选择的8个微卫星位点最多可以鉴定598个已知性别的亲本或431个未知性别的亲本.[结论]所选的Hl18、H137、H165、H148、4703、C2489、H57、H81等8对微卫星标记可在生产及科研试验中用于获取草鱼系谱信息.     

利用18个微卫星座位对剑尾鱼RR-B系遗传质量的分析(英文)

[Objective] The study aimed to further understand the genetic quality of Xiphophorus helleri RR-B strain and estimate the feasibility of microsatellite markers in genetic monitoring of aquatic laboratory animals.[Method] Eighteen microsatellite loci which had polymorphism in wild X. helleri were used for genetic quality analysis of RR-B strain (red eyes and red body) by PCR. [Result] All these 18 microsatellite loci displayed single allelic gene band in 30 individuals of X. helleri RR-B strain and the average homozygote rate reached 100%. [Conclusion] These loci could be used as markers in genetic monitoring of X. helleri RR-B strain, which had obtained fairly high genetic homozygosity by inbreeding for more than 20 generations. This study provided basic data for establishing the molecular genetic monitoring standard of aquatic laboratory animals.     

大口黑鲈PACAP基因SNPs的筛选及其与生长性状的关联分析

垂体腺苷酸环化激酶多肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP)是一种能够促进生长激素、促性腺激素和催乳素分泌的多效激素,属于胰高血糖素/分泌肽家族的成员.为探索PACAP基因多态性对大口黑鲈(icropterus salmoides)生长性状的影响,本研究采用直接测序的方法在PACAP基因上检测到一个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点:A-2282C,基因型检测共发现3种基因型:AA、AC和CC,其基因型频率分别为0.034、0.645和0.321,A等位基因频率为0.356 3,C等位基因频率为0.643 7.随机选取同批繁殖、同塘养殖的327尾大口黑鲈用Snapshot方法进行SNPs位点检测和分型,构建最小二乘分析模型,分析基因型与生长性状的相关性.X2检测结果显示,哈温-平衡常数为0.061 5,即该位点在所检测大口黑鲈群体中基本处于Hardy-Weinberg平衡状态,有效等位基因数(Ne)为1.846 5,期望杂合度(Ho)和观测杂合度(He)分别为0.540 9和0.644 2.方差分析结果显示,AC基因型群体的平均体质量、体高和全长相对于AA基因型群体分别增长了30.6％、10.7％和8.3％,相对于CC基因型群体分别增长了10.5％、4.7％和2.7％;且AC基因型群体在体质量、体高和全长上显著高于AA和CC基因型群体(P＜0.05).另外,虽然AA基因型群体的平均体质量、体高和全长相对于CC基因型群体分别增长了18.1％、5.8％和5.4％,但AA型群体和CC群体在各生长性状上没有显著差异(P＞0.05).该位点可能是影响大口黑鲈生长性状的的主效数量性状核苷酸(quantitative trait nucleotides,QTN)或与之紧密连锁,可作为大口黑鲈选育的候选分子标记.     

大口黑鲈LPL基因SNPs及其与适应人工配合饲料能力的相关性研究

大口黑鲈(Micropterus salmoides)为肉食性经济鱼类,喜食活饵或冰鲜鱼,养殖过程中大量投喂冰鲜鱼或大量使用鱼粉作为饲料,增加了养殖成本,且容易对环境造成污染。为了降低养殖成本、保护环境,使其适合喂食蛋白含量适中的人工配合饲料,提高大口黑鲈对人工配合饲料的适应能力,选育适合食人工配合饲料的大口黑鲈是解决这个问题的有效途径。有研究表明,饲料中的脂肪水平对大口黑鲈的脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)的表达水平有显著的影响。本研究以大口黑鲈LPL基因作为候选基因,根据已知的c DNA序列设计引物,PCR扩增测序得到大口黑鲈LPL type1基因组序列6 170 bp,包括10个外显子和9个内含子,LPL type2基因组序列4 419 bp,包括5个外显子和4个内含子。利用直接测序法,在LPL type1基因中筛选到11个SNP位点,在LPL type2中筛选到6个SNP位点。将1个喂食冰鲜鱼的成鱼养殖群体中的192尾鱼和1个幼鱼驯食养殖群体中的142尾鱼,分别用筛选得到的SNP位点进行基因分型,结果发现,在LPL type1基因中筛选到的11个SNP位点紧密连锁,用T+156A表示;在LPL type2基因中筛选到的6个SNP位点也紧密连锁,用C-224T表示,而LPL type1和LPL type1的SNP位点间不存在连锁关系,且SNP位点所构成的基因型在两个群体中的分布频率相似。将上述SNP位点所构成的基因型与两个大口黑鲈群体的体重、全长和体高等生长性状进行相关性分析,结果表明,LPL基因中的SNP位点虽然与成鱼的生长性状不存在显著的相关性,但在LPL type1基因T+156A SNP位点的AA基因型与TT基因型与幼鱼在驯食后的饱食与空腹状态存在显著的相关性,且AA基因型在幼鱼体质量和全长两个性状上存在显著的优势(P0.05),说明T+156A SNP位点与大口黑鲈适应人工配合饲料的能力有显著相关。LPL type1基因可作为提高大口黑鲈成活率、选育适合食人工配合饲料大口黑鲈的潜在候选基因。本研究为推进大口黑鲈适应人工配合饲料新品种的选育工作提供了可靠的研究数据,也为其他肉食性鱼类的驯食选育工作提供了借签和参考。     

基于转录组测序的大口黑鲈驯食相关SNP开发及其与生长性状的关联分析

大口黑鲈为肉食性鱼类,传统养殖过程中使用大量的冰鲜鱼为饵料,冰鲜鱼的使用不仅增加了养殖成本,而且多余的冰鲜鱼残饵还会给环境带来严重的污染。为了保护环境并降低养殖成本必须减少冰鲜鱼的使用量,本实验以选育适合人工配合饲料饲喂大口黑鲈为研究目标,用人工配合饲料作为饵料驯化大口黑鲈幼鱼,在驯食后14和16 d,测定其体质量、全长、体高等生长指标。同时在大口黑鲈转录组测序分析获得的SNP位点中,选择其所在序列的基因功能与能量代谢有相关性的7个SNP位点进行SNaPshot分型,用SPSS 19.0进行卡方分析标记与生长性状的相关性。结果发现,序列Unigene031044中的C1332G位点、Unigene085384中的A741G位点和Unigene022319中的A284G位点在体质量、全长及体高性状上存在显著差异。这3个SNP位点所在的基因经预测分别与雌二醇17β脱氢酶12B (hsd17b12b)基因、长链酰基辅酶A合成酶家族成员1(acsl1)基因和琥珀酸脱氢酶组装因子2(sdhaf2)基因具有很高的同源性,推测上述3个SNP位点的变异可能影响了基因表达产物对脂肪酸代谢或三羧酸循环的调节功能,与大口黑鲈对人工配合饲料的利用能力存在密切的相关性。本研究筛选得到的与驯食相关的SNP位点为大口黑鲈功能基因多态性的进一步研究,及加快大口黑鲈食性改良与驯化育种的遗传研究提供了科学的参考依据。     

三种罗非鱼的微卫星分子鉴定和遗传结构分析

采用77对微卫星引物对奥利亚、尼罗和橙色莫桑比克三种罗非鱼基因组DNA进行PCR扩增,筛选出17个微卫星鉴定位点,其中奥利亚罗非鱼的特异位点UNH636、UNH117、UNH172、UNH738、UNH878、UNH896;尼罗罗非鱼的特异位点UNH913、UNH907、UNH222、UNH980 、UNH880和橙色莫桑比克罗非鱼的特异位点UNH876、UNH899、UNH853、UNH932、UNH933、UNH773,任意一个位点可在其中一种罗非鱼中扩增出其它两种罗非鱼不具有的条带,从而将这种罗非鱼与其它两种区分开来。利用这17个位点检测三种罗非鱼的遗传结构,共检测到142个等位基因,平均等位基因8.35个,数据经Popgen32计算和MEGA4软件作图,进行了聚类分析,确立了三种罗非鱼的亲缘关系。结果表明,奥利亚、尼罗、橙色莫桑比克三种罗非鱼的平均观测杂合度分别为0.0941、0.5490、0.2588,平均期望杂合度分别为0.1089、0.7230、0.2608,平均多态信息含量分别为0.0869、0.7149 、0.1643,由此可见,尼罗罗非鱼群体的遗传多样性水平最高,奥利亚罗非鱼群体遗传多样性最低;聚类分析显示奥利亚群体和橙色莫桑比克群体间的亲缘关系较近,与前人研究结果一致。     

大口黑鲈hepcidin真核表达载体构建及表达的初步研究

将大口黑鲈(Micropterus salmoides)抗菌肽hepcidin cDNA定向插入真核表达载体pPICZαA,通过SacI酶切线性化重组表达质粒pPICZαA-hepcidin,电转化毕赤酵母P.pastoris GS115,PCR扩增筛选,甲醇诱导表达等进行了hepcidin真核表达工程菌株的构建及诱导表达。结果显示:hepcidin cDNA成功插入表达载体pPICZαA,并整合到酵母基因组中;经甲醇诱导,RT-PCR检测显示hepcidin cDNA在酵母细胞中成功转录。