不同剂量的猪瘟活疫苗单次免疫效果评价及疫苗存留试验

用1 200 RID、6 000 RID和24 000 RID 3种不同剂量的猪瘟活疫苗单次免疫9头30日龄的断奶仔猪,检测试验猪的抗体消长和疫苗毒核酸在猪体内的存留时间,并用6头猪进行攻毒保护试验.结果表明:不同免疫剂量的试验猪其抗体水平的动态变化没有显著差异,免疫后21 d试验猪的猪瘟抗体均成阳性,63 d后至578 d猪瘟抗体阻断率仍然高于85％,应用荧光定量RT-PCR技术检测,猪瘟疫苗毒核酸在猪血液和扁桃体中的检出时间分别达28 d和42 d;免疫后370 d进行猪瘟强毒攻击后,免疫猪没有出现明显的临床症状,存活且不带毒.本研究证实,没有其他疫病和母源抗体的仔猪单次接种合理剂量的猪瘟活疫苗就能产生坚强的保护力,提出加强种猪场各种病原监测,淘汰病原阳性种猪,净化种猪群对提高猪瘟疫苗免疫效果,最终控制猪瘟具有重要意义.     

猪瘟病毒野毒株TaqMan-MGB荧光定量PCR、鉴别方法的建立与应用

 【目的】建立一种快速、敏感、特异地检测猪瘟病毒野毒的一步TaqMan-MGB 荧光定量PCR方法,为临床鉴别猪瘟野毒和HCLV疫苗毒提供了准确可靠的工具。【方法】在猪瘟病毒基因组5′端非编码保守区设计一对猪瘟病毒通用引物和一条特异性MGB探针,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件,进行特异性、灵敏度和临床样本符合检验。【结果】该方法在100～10-7范围内线性相关系数为0.998,检测极限达5.3×10-2pg 病毒核酸;对24个质控样本检测结果显示,该方法能检测除猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）以外的猪瘟流野毒株,其它猪相关致病病原检测阴性;对122份疑似猪瘟样本检测的结果与本实验室建立的RT-nPCR方法的符合率为94.3％（115/122）,阳性和阴性符合率分别为86.4％（38/44）和98.7％（77/78）,Kappa值为0.87＞0.75。【结论】建立的一步TaqMan-MGB 荧光定量PCR方法能鉴别猪瘟野毒和HCLV疫苗毒,且特异性好、灵敏度高、与笔者先前建立的RT-nPCR方法对临床样本的检测结果具有高度的一致性。     

中国兽医药品监察所OIE猪瘟参考实验室猪瘟研究进展

<正>中国兽医药品监察所国家猪瘟参考实验室是由农业部2002年公布的第一批国家参考实验室,2017年6月1日,世界动物卫生组织(OIE)确认中国兽医药品监察所猪瘟实验室成为新的OIE猪瘟参考实验室,该实验室是国内最早开展猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)     

猪瘟病毒E2基因噬菌体展示多肽库的构建及表位鉴定

本研究通过建立CSFV噬菌体展示多肽库,并对其进行生物淘选,以期获得E2蛋白上新的抗原表位.选择CSFV石门株(SM)和疫苗株(HCLV)为代表株,采用噬菌体展示技术,以T7select415-1b为载体,分别构建了CSFV SM株和HCLV株E2基因噬菌体展示多肽库(SM-E2库和HCLV-E2库).通过生物淘选和噬菌体原位杂交技术,采用7株猪瘟单克隆抗体和1株猪瘟高免血清分别对构建的SM-E2库和HCLV-E2库进行抗原表位筛选.结果共筛选到了5条与E2蛋白高度同源的序列,在E2蛋白上的同源区域分别为TAVSPTTLR、YYEP、TTWKEYSH、GGQ(V)VK和PDGLPHY.结果表明,TAVSPTTLR、YYEP和TTWKEYSH序列与目前已知E2蛋白表位一致,说明它们是E2蛋白上的优势表位;GGQ(V)VK和PDGLPHY序列与预测表位一致,推测是E2蛋白上潜在的抗原表位.     

猪细小病毒LAMP检测方法的建立

 【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪细小病毒(PPV)环介导等温扩增(LAMP)方法,为诊断猪细小病毒提供准确可靠工具。【方法】根据GenBank公布的PPV序列,在其保守序列区域设计了多套LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程并筛选最佳引物、反应条件,建立了对PPV病毒DNA进行特异扩增的 LAMP检测方法,并可通过加入SYBR Green I肉眼判断结果。【结果】该方法在63℃恒温下作用45 min,PPV病毒DNA获得了高效率的特异性扩增;其检出限量为0.23 TCID50,敏感性高;在反应结束后加入SYBR Green I肉眼判断结果,与Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。通过对20份临床样品的LAMP检测与免疫荧光鉴定、PCR方法比对,符合率均为20/20。【结论】本研究建立的PPV LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏,操作简单、设备要求低的特点,适合用于临床PPV快速检测。     

应用CSFV-E2基因噬菌体肽库筛选猪瘟病毒抗原表位

采用猪瘟单抗对猪瘟病毒石门株E2基因噬菌体随机肽库(SM-E2库)进行淘洗以研究猪瘟病毒E2抗原表位.运用猪瘟单克隆抗体WH303、WH211和M56对SM-E2库进行4轮生物淘洗,对阳性克隆再经噬菌体原位杂交、特异PCR测序分析,然后人工合成阳性多肽进行ELISA反应.经鉴定分析发现单抗WH303从SM-E2库中筛选得到一段CSFV特异的抗原多肽IECTAVSPTTLRTEVVKT,并且该段多肽与已知CSFV表位TAVSPTTLR极为相似;单抗WH211和M56未能筛选到包含CSFV序列的克隆.结果表明,利用靶基因噬菌体随机多肽库筛选抗原表位能够得到更接近于真实表位的抗原表位.     

急性感染猪瘟病毒猪体外排毒规律的观察

为研究CSFV感染后在体外的传播途径、排毒规律,针对CSFV基因组设计了一对引物和一条探针,建立了一套CSFV荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法,并以质粒为标准品得到扩增标准曲线.对18个CSFV阳性质控样本检测全阳性,6个CSFV阴性质控样本检测全阴性,显示良好敏感性和特异性.应用此方法对石门株感染的16头60日龄长白猪和1头阴性对照猪的粪便、尿液、眼分泌物和唾液中病毒含量进行了动态测定,结果表明从感染后第1天到频死前第8天,粪便中均能检测出病毒;尿液和眼分泌物至少能从第3天,唾液从第4天开始检测出病毒,且病毒含量呈增加趋势.本研究对急性感染猪瘟病毒猪体外排毒规律进行了系统研究,为弄清CSFV感染病程、致病机理及临床诊断奠定了重要理论基础.     

猪源大肠杆菌血清型耐药性整合子调查

分别在北京地区采集正常猪泄殖腔拭子50份,河南123份,分离到大肠杆菌150株,分离率为86.7%.菌株血清型分布广,呈地区性、多样性和可变性.北京菌株耐药率低,除对四环素为73.8%外,对其他21种药物耐药率均在16.7%以下;河南地区菌株耐药率高,对青霉素类、磺胺甲基异噁唑高达75.0%以上.北京地区菌株整合子携带率为18.6%,河南地区为75.7%.整合子携带频率与细菌耐药性相关.     

P10B抗菌肽和硫酸小檗碱对肉鸡源大肠杆菌的体外联合抗菌作用研究

为了解P10B抗菌肽与硫酸小檗碱联合抗菌作用,进行P10B抗菌肽与硫酸小檗碱联用的体外抑菌试验。试验菌株为20株肉鸡源大肠杆菌菌株。采用微量肉汤稀释法测定P10B与硫酸小檗碱对大肠杆菌的最低抑菌浓度;棋盘稀释法测定两个药的分级抑菌浓度指数,判断联合抗菌效果。结果表明,在联合药敏试验中,两药呈协同作用的占10%,呈相加作用的占85%,呈无关作用的占5%。平均分级抑菌浓度指数为0.825,两种药联和用药效应主要表现为累加作用。     

实时荧光定量PCR技术

荧光定量PCR技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的,具有灵敏度高、特异性强、线性关系好、操作简单等优点,不但能够用于基因定量检测,还能准确定量疾病相关基因的表达,现已广泛应用于人类和动物疾病的快速检测、定量分析、早期诊断、基因分型等方面。它可以采用绝对定量和相对定量2种方式实现定量检测,但都有各自的优缺点,需根据具体的试验选择合适的定量方式,从而得到更准确的试验结果。提高荧光定量PCR技术的特异性和灵敏度需从多方面着手,主要指特异性探针及引物的设计,选择合适的Mg2 浓度、引物和探针浓度、循环数等。