绿竹BoGPIAP基因克隆与异位表达研究

糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPIAP)因其结构和功能的多样性,决定了它在各种生物学过程中都发挥着重要作用。采用同源克隆的方法从绿竹(Bambusa oldhamii)中获得一个GPIAP同源基因,命名为BoGPIAP,cDNA全长1 772 bp,其中包括1 356 bp的开放阅读框,编码一个451 aa的的蛋白。蛋白结构分析表明,该蛋白包含1个典型的GPIAP家族保守区域(47-211)和1个CCVS结构域,在N-端和C-端分别具有1个跨膜信号肽和1个GPI锚定信号肽,属于GPIAP家族。构建BoGPIAP与GFP融合的表达载体,在洋葱表皮细胞中瞬时表达,结果显示BoCOBL::GFP融合蛋白定位于细胞膜上,证明BoGPIAP基因编码的蛋白为膜蛋白。分别构建BoGPIAP的正义、反义表达载体并转化烟草(Nicotiana tabacum)。PCR检测结果表明,BoGPIAP已转入烟草。与野生型相比,转反义基因植株细弱,纤维细胞壁明显变薄;而转正义基因植株粗壮,纤维细胞壁明显变厚。表明BoGPIAP可能对竹子纤维细胞壁的发育具有调控作用。     

开花麻竹叶绿素荧光参数测定

叶绿素荧光是研究光合作用的有效探针。为了探讨开花对麻竹光合作用的影响,应用PAM-100分别测定了开花与未开化麻竹的叶绿素荧光参数。结果表明,随着光强的升高[0~2 000μmol/（m^2·s）],在开始阶段[0~200μmol/（m^2·s）]麻竹叶片的NPQ、Y（NPQ）、Y（ND）、ETR（Ⅱ）和ETR（Ⅰ）均迅速升高,Y（Ⅱ）和Y（Ⅰ）却迅速下降,之后变化缓慢并趋于平稳,而Y（NA）和Y（NO）几乎一直维持平稳;其中未开花麻竹的NPQ、Y（Ⅰ）和ETR（Ⅰ）均高于开花麻竹,Y（Ⅱ）、Fv/Fm和ETR（Ⅱ）无明显差异。在本实验培养光照下[230μmol/（m2·s）],未开花麻竹的NPQ、Y（Ⅰ）和ETR（Ⅰ）也均高于开花麻竹。由此表明,开花引起麻竹PSⅠ的Y（Ⅰ）和ETR（Ⅰ）以及PSⅡ的NPQ降低,这意味着开花麻竹的光保护能力下降,使得PSⅠ受体侧电子积累,导致光合效率下降。     

紫竹多酚氧化酶基因克隆及其表达

为研究紫竹Phyllostachys nigra多酚氧化酶基因（PPO）表达与紫竹组培苗褐化之间的关系,采用同源克隆方法获得紫竹PPO基因的cDNA与DNA片段,将它命名为PnPPO。随后,研究了该基因在不同褐化程度紫竹组培苗中的表达情况。序列分析显示该基因所编码蛋白为酪氨酸酶（tyrosinase）,其序列与小麦Triticum aestivum和水稻Oryza sativa中PPO基因同源性很高,是PPO的同源序列。RT-PCR分析显示,在褐化严重的组培苗中PnPPO的表达量也较高。这说明PnPPO基因的表达与紫竹组培苗褐化存在紧密的联系。图4参15     

毛竹PeGRF1基因克隆及初步功能分析

为了探究生长调控因子(GRF)转录因子在竹笋-茎秆生长中的作用,本研究以毛竹(Phyllostachys edulis)为材料,通过RT-PCR方法进行GRF基因的克隆,应用生物信息学方法对其序列进行分析,利用RT-qPCR对其在毛竹竹笋-幼竹的生长过程中的表达模式进行分析,并通过在拟南芥中异位表达初步分析其功能.结果 表明,从毛竹中克隆获得1个1164bp的GRF基因,命名PeGRF1,其编码387个氨基酸;蛋白序列分析表明PeGRF1具有完整的GRF特征结构域WRC和QLQ.进化分析显示,PeGRF1与水稻等单子叶植物的GRFs聚类在较近的分支,亲缘关系较近.在毛竹竹笋生长过程中,PeGRF1主要在幼嫩竹笋中表达,在快速生长阶段的表达量明显高于生长缓慢时期,在竹笋顶端及中部的表达量明显高于基部.过量表达PeGRF1能增加转基因拟南芥的株高.本研究结果可为阐明GRF基因在竹子的生物学功能提供了参考.     

陈山红心杉良种造林幼龄期密度效应分析

[目的]探讨陈山红心杉不同良种和初植密度对其幼龄期生长的影响及其互作效应,旨在为红心杉良种的初植密度优化提供理论依据.[方法]以2015年在江西省吉安市青原区白云山林场营造的红心杉试验林为研究对象,采用完全随机区组设计,根据连续5年树高、胸径等调查数据,分析2个陈山红心杉种子园良种(1代良种和1.5代良种)和4个初植密...     

毛竹早期光诱导蛋白基因克隆及功能分析

  目的  探究早期光诱导蛋白(ELIP)基因在竹子光保护中的作用,为进一步阐述竹子光保护机制提供参考依据。  方法  以毛竹Phyllostachys edulis实生苗为材料,在前期研究的基础上克隆毛竹ELIP基因,利用qRT-PCR技术研究其在不同光照诱导下的表达谱,同时通过在拟南芥Arabidopsis thaliana中异位表达对1个基因的功能进行初步鉴定。  结果  克隆获得了3个毛竹ELIP基因(PeELIP1、PeELIP2和PeELIP3),分别编码165、179和182个氨基酸。蛋白结构分析表明:3个PeELIPs蛋白均具有典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域,含3个α-螺旋跨膜结构,属于叶绿素a/b结合蛋白超家族。序列比对及进化分析表明:PeELIPs与水稻Oryza sativa、玉米Zea mays等单子叶植物的ELIPs相似性较高,同源性达72%以上,聚类在同一分支。qRT-PCR分析表明:3个PeELIPs基因在毛竹黄化苗中仅检测到微弱表达,光照处理使3个基因的表达量均显著上调;同时在正常毛竹实生苗叶片中,随着光照强度的增强和强光胁迫处理时间的延长,3个PeELIPs基因的表达量都显著上调。过表达PeELIP3可减缓转基因拟南芥在强光下F_v/F_m的下降幅度,但未影响转基因植株的非光化学猝灭系数。  结论  毛竹中至少存在3个PeELIPs,且其表达均受光照的诱导。过量表达PeELIP3能够减缓转基因拟南芥受光抑制的程度,具有一定的光保护作用。图8表1参40     

毛竹miR397和miR1432的克隆及其逆境胁迫响应表达分析

【目的】miRNA作为一种非编码基因在植物生长发育以及抗逆等过程中起着重要的调控作用。通过分析毛竹 miR397和 miR1432前体序列的结构特点,研究其组织表达特异性,分析其经光照、温度、干旱、NaCl等非生物胁迫以及激素处理后的表达变化,以期为进一步揭示其功能以及未来竹子抗逆育种的分子设计提供参考。【方法】通过茎环引物法和 RT-PCR技术,以毛竹为材料分离 miR397和 miR1432的前体序列,利用在线平台 Web LOGO分析 miRNA成熟序列的碱基保守性,用 MEGA 6.0软件构建基于 miRNA 前体的系统进化树。借助在线平台 RNAfold WebServer预测二者前体二级结构。直接从 BambooGDB下载 phe-miR397和 phe-miR1432前体上游的1500 bp序列,利用在线平台 Plant CARE 分析其所含作用元件。采用实时定量 PCR 方法分析 phe-miR397和 phe-miR1432在毛竹根、茎、叶和鞘中的表达情况,以及检测经黑暗、强光(1500μmol·m －2 s －1)、高温(42℃)、低温(4℃)、NaCl(250 mmol·L －1)、GA3溶液(100μmol·L －1)、ABA溶液(100μmol·L －1)处理2 h后毛竹叶片中 phe-miR397和 phe-miR1432的表达变化。【结果】从毛竹中分别克隆出 miR397和 miR1432的前体序列,均为88 bp,且分别包含其成熟序列,均为21 bp。前体序列均能形成稳定的茎环结构,且成熟序列均产生于前体茎环结构5'端臂上。miR1432家族成熟序列的碱基保守性整体高于 miR397家族。毛竹二者前体上游调控区均含有启动子基本作用元件,如 TATA-box,CAAT-box;同时存在很多逆境(光、干旱、温度等)胁迫相关响应元件以及激素响应元件等,意味着 phe-miR397和 phe-miR1432可能受到逆境胁迫和激素的调节。phe-miR397和phe-miR1432均在叶鞘中表达丰度最高,最低丰度 phe-miR397出现在幼茎中,而 phe-miR1432则在叶片中。经强光、黑暗、高温、低温、NaCl等胁迫处理后,叶片中 phe-miR397和 phe-miR1432的表达均下调;干旱和 ABA 处理后,phe-miR397的表达下调,而 phe-miR1432则上调; GA3处理后,phe-miR397的表达上调,phe-miR1432则下调。【结论】phe-miR397和 phe-miR1432作为毛竹中2个保守型 miRNA,在受光照、温度、干旱和 NaCl 的胁迫以及ABA和 GA3的处理时,其表达均呈现了不同程度的下调或上调,这暗示着它们可能在毛竹应对非生物胁迫的抗逆过程中起重要的调控作用,且与内源激素的调节相关联。     

毛竹种源遗传多样性的AFLP和ISSR分析

运用AFLP和ISSR分子标记对17个毛竹种源的遗传多样性进行分析,结果如下：①通过Mantel检测,AFLP和ISSR标记得到的遗传相似性矩阵呈显著相关（r=0．925,P=0．005）,说明2种分子标记均适合用于毛竹种源遗传多样性的分析;②17个毛竹种源间的亲缘关系较近,但仍存在着一定的遗传变异,它们之间的遗传距离变化范围为0．020-0．182,通过聚类分析（UPGMA）将17个毛竹种源分成6个组,发现陈存及等根据产量等指标确立的4个毛竹优良种源位于不同的组,表明不同种源间存在性状差异。