绿竹BoGPIAP基因克隆与异位表达研究

糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPIAP)因其结构和功能的多样性,决定了它在各种生物学过程中都发挥着重要作用。采用同源克隆的方法从绿竹(Bambusa oldhamii)中获得一个GPIAP同源基因,命名为BoGPIAP,cDNA全长1 772 bp,其中包括1 356 bp的开放阅读框,编码一个451 aa的的蛋白。蛋白结构分析表明,该蛋白包含1个典型的GPIAP家族保守区域(47-211)和1个CCVS结构域,在N-端和C-端分别具有1个跨膜信号肽和1个GPI锚定信号肽,属于GPIAP家族。构建BoGPIAP与GFP融合的表达载体,在洋葱表皮细胞中瞬时表达,结果显示BoCOBL::GFP融合蛋白定位于细胞膜上,证明BoGPIAP基因编码的蛋白为膜蛋白。分别构建BoGPIAP的正义、反义表达载体并转化烟草(Nicotiana tabacum)。PCR检测结果表明,BoGPIAP已转入烟草。与野生型相比,转反义基因植株细弱,纤维细胞壁明显变薄;而转正义基因植株粗壮,纤维细胞壁明显变厚。表明BoGPIAP可能对竹子纤维细胞壁的发育具有调控作用。     

开花麻竹叶绿素荧光参数测定

叶绿素荧光是研究光合作用的有效探针。为了探讨开花对麻竹光合作用的影响,应用PAM-100分别测定了开花与未开化麻竹的叶绿素荧光参数。结果表明,随着光强的升高[0~2 000μmol/（m^2·s）],在开始阶段[0~200μmol/（m^2·s）]麻竹叶片的NPQ、Y（NPQ）、Y（ND）、ETR（Ⅱ）和ETR（Ⅰ）均迅速升高,Y（Ⅱ）和Y（Ⅰ）却迅速下降,之后变化缓慢并趋于平稳,而Y（NA）和Y（NO）几乎一直维持平稳;其中未开花麻竹的NPQ、Y（Ⅰ）和ETR（Ⅰ）均高于开花麻竹,Y（Ⅱ）、Fv/Fm和ETR（Ⅱ）无明显差异。在本实验培养光照下[230μmol/（m2·s）],未开花麻竹的NPQ、Y（Ⅰ）和ETR（Ⅰ）也均高于开花麻竹。由此表明,开花引起麻竹PSⅠ的Y（Ⅰ）和ETR（Ⅰ）以及PSⅡ的NPQ降低,这意味着开花麻竹的光保护能力下降,使得PSⅠ受体侧电子积累,导致光合效率下降。     

单叶省藤和黄藤基因组组装研究

单叶省藤（Calamus simplicifolius）和黄藤（Daemonorops jenkinsiana）是棕榈藤的2种重要的代表藤种,是藤工业化利用的主要原材料。然而,棕榈藤参考基因组的空白成为开展其基础生物学和应用生物学研究的主要障碍。本研究通过使用Illumina、Pacific Biosciences和基于染色体构象捕获技术的基因组辅助组装测序等高通量测序技术,完成了单叶省藤和黄藤染色体水平上基因组的组装。项目测序共分别得到约730 Gb和约682 Gb的原始数据,分别相当于预测基因组覆盖度（单叶省藤约1.98 Gb,黄藤约1.61 Gb）的372倍和426倍。另外,单叶省藤和黄藤的scaffold N50分别为160 Mb和119 Mb。在单叶省藤和黄藤的基因组分别注释出51 235和53 342个完整的蛋白质编码基因模型。通用单拷贝直系同源评估表明,2种藤基因组组装的完整性分别达到96.4%和91.3%。进化分析显示,4种棕榈科植物聚在一支上,单叶省藤和黄藤的分化时间约出现于1 930万年前。此外,还分别在单叶省藤和黄藤的基因组中鉴定了193个和172个参与木质素生物合成的基因。这些数据不仅为开展藤功能基因组学研究提供了基础资源,促进种质资源的育种应用,而且还作为开展种间及不同物种之间的比较研究提供了参考基因组。     

共表达网络分析揭示棕榈藤纤鞭生长动态调控模块

棕榈藤是世界上仅次于树木与竹子的最重要非木森林资源。2018年国际竹藤中心全球首次发布了棕榈藤全基因组序列（单叶省藤和黄藤），极大促进了棕榈藤基因功能的研究。基因共表达网络分析有助于在转录组层面提供完整全面的基因功能注释，因此本研究整合棕榈藤基因组序列和不同发育阶段的纤鞭转录组数据进行了共表达网络分析。通过整合共表达网络、基因家族分类和功能富集等分析，分别在单叶省藤和黄藤中鉴定得到3 504和3 027个功能模块，包括光合作用、木质素生物合成、类黄酮生物合成、苯丙素生物合成等主要的生物学过程。同时，使用共表达网络和功能模块对基因的功能注释进行了优化，对棕榈藤纤鞭生长调控有了新的认知。最后，构建了首个棕榈藤组学在线数据库——Rattan-NET （http：//rattan.bamboogdb.org/），包含基因集富集、模块富集、网络比较和顺式作用元件等分析工具，可供研究人员开放使用。     

毛竹miR397和miR1432的克隆及其逆境胁迫响应表达分析

【目的】miRNA作为一种非编码基因在植物生长发育以及抗逆等过程中起着重要的调控作用。通过分析毛竹 miR397和 miR1432前体序列的结构特点,研究其组织表达特异性,分析其经光照、温度、干旱、NaCl等非生物胁迫以及激素处理后的表达变化,以期为进一步揭示其功能以及未来竹子抗逆育种的分子设计提供参考。【方法】通过茎环引物法和 RT-PCR技术,以毛竹为材料分离 miR397和 miR1432的前体序列,利用在线平台 Web LOGO分析 miRNA成熟序列的碱基保守性,用 MEGA 6.0软件构建基于 miRNA 前体的系统进化树。借助在线平台 RNAfold WebServer预测二者前体二级结构。直接从 BambooGDB下载 phe-miR397和 phe-miR1432前体上游的1500 bp序列,利用在线平台 Plant CARE 分析其所含作用元件。采用实时定量 PCR 方法分析 phe-miR397和 phe-miR1432在毛竹根、茎、叶和鞘中的表达情况,以及检测经黑暗、强光(1500μmol·m －2 s －1)、高温(42℃)、低温(4℃)、NaCl(250 mmol·L －1)、GA3溶液(100μmol·L －1)、ABA溶液(100μmol·L －1)处理2 h后毛竹叶片中 phe-miR397和 phe-miR1432的表达变化。【结果】从毛竹中分别克隆出 miR397和 miR1432的前体序列,均为88 bp,且分别包含其成熟序列,均为21 bp。前体序列均能形成稳定的茎环结构,且成熟序列均产生于前体茎环结构5'端臂上。miR1432家族成熟序列的碱基保守性整体高于 miR397家族。毛竹二者前体上游调控区均含有启动子基本作用元件,如 TATA-box,CAAT-box;同时存在很多逆境(光、干旱、温度等)胁迫相关响应元件以及激素响应元件等,意味着 phe-miR397和 phe-miR1432可能受到逆境胁迫和激素的调节。phe-miR397和phe-miR1432均在叶鞘中表达丰度最高,最低丰度 phe-miR397出现在幼茎中,而 phe-miR1432则在叶片中。经强光、黑暗、高温、低温、NaCl等胁迫处理后,叶片中 phe-miR397和 phe-miR1432的表达均下调;干旱和 ABA 处理后,phe-miR397的表达下调,而 phe-miR1432则上调; GA3处理后,phe-miR397的表达上调,phe-miR1432则下调。【结论】phe-miR397和 phe-miR1432作为毛竹中2个保守型 miRNA,在受光照、温度、干旱和 NaCl 的胁迫以及ABA和 GA3的处理时,其表达均呈现了不同程度的下调或上调,这暗示着它们可能在毛竹应对非生物胁迫的抗逆过程中起重要的调控作用,且与内源激素的调节相关联。     

竹类植物基因组学发展的机遇与挑战

概述了竹类植物基因组学研究进展,包括对核酸信息的认知以及通过反向遗传学对重要性状相关基因功能的认知;分析了目前包括现代生物技术、可再生生物资源、生态文明所带来的良好发展机遇;提出了竹类植物基因组复杂、开花特殊、遗传转化体系不完善等基因组学研究所面临的瓶颈问题及其对策。     

毛竹KNOX基因家族全基因组鉴定和组织表达特异性分析

为了探究KNOX基因在竹子快速生长中的作用,本研究以毛竹(Phyllostachys edulis)为对象,通过同源比对从毛竹基因组中获得12条KNOX同源基因序列。序列分析表明,PeKNOXs的基因结构差异较大,内含子数目1～6个不等,且长度差异较大(30～3 801 bp),但都符合GT-AG剪切原则。PeKNOXs编码蛋白的长度为145～355 aa,分子量为92～130 k D。系统进化分析表明,毛竹PeKNOXs被聚类到2个较大的分支,分别属于Ⅰ、Ⅱ类KNOX亚家族,Ⅰ类中包含PeKNOX1-1～PeKNOX1-5,其中PeKNOX1-1与OSH71、PeKNOX1-2与OSH10、PeKNOX1-3与OSH15均聚类到一起,而PeKNOX1-4和PeKNOX1-5与OSH43聚类到较近的分支;Ⅱ类中包含PeKNOX2-1～PeKNOX2-7,其中PeKNOX2-1和PeKNOX2-2聚类到一个分支,与其它PeKNOXs距离较远,而且PeKNOXs与已知拟南芥的KNATs距离均较远。利用毛竹转录组数据构建热图进行分析,表明除了PeKNOX2-1外,其余PeKNOXs均检测到表达,但2个亚家族不同成员的表达均存在着一定的差异,如PeKNOX1-3的相对表达量最高,PeKNOX1-5的最低。实时定量PCR验证表明,PeKNOX1-3和PeKNOX1-5在不同组织中均有表达,其中在节中表达量最高,其次是茎,而在叶片和叶鞘中的表达量均较低,这与转录组数据相类似。由此表明,PeKNOXs可能在竹子生长发育中起重要调控作用,为进一步利用PeKNOXs开展竹子基因工程研究提供了参考。     

毛竹捕光色素结合蛋白基因结构及表达模式分析

植物通过光合作用将光能转换为化学能,捕光色素结合(LHC)蛋白与色素形成的复合体在捕获、传递和转化光能过程中发挥着重要作用,因此研究毛竹(Phyllostachys edulis)LHC基因结构及表达模式对于揭示其在毛竹光合作用中的功能具有重要意义。采用生物信息学的方法,对毛竹基因组中的LHC基因进行了系统分析。结果表明,在毛竹中共有29个LHC基因同源序列,其包含的内含子数量为0~5个。序列分析表明,29个LHC基因编码的蛋白分别属于光系统Ⅰ和光系统Ⅱ的捕光色素结合蛋白家族LHCⅠ和LHCⅡ。LHCⅠ包含5个亚家族(Lhca 1-Lhca 5),除了Lhca 4含有3个成员外其他亚家族只有1个成员;而LHCⅡ包含6个亚族(Lhcb 1-Lhcb6),每个亚家族的成员不同,其中Lhcb 1的成员最多为7个。亲疏水性预测表明,不同亚家族成员存在着一定差异。蛋白结构预测发现,29个蛋白均包含导肽和成熟蛋白,具有跨膜结构域,均包含色素结合位点;其中12个蛋白的组成以α-螺旋为主,17个蛋白的组成以随机卷曲为主。基因表达谱分析表明,大多数LHC基因主要在叶片和花序中表达,笋中略有表达,而根和鞭中几乎检测不到表达。研究结果为进一步研究毛竹LHC基因的功能奠定了基础。     

基于毛竹重测序的基因可变剪接研究

虽然测序技术得到显著提高,组学数据大量出现,但是竹子仍然缺少染色体水平的基因组,并且竹子中基因的可变剪接（AS）进化情况仍不清楚。本研究通过使用大量的组学数据和基于染色体构象捕获技术的基因组辅助（Hi-C）组装策略,组装得到了染色体水平的毛竹（Phyllostachys edulis）基因组,基因组质量显著提升,Scaffold N50达到79.90 Mb,是上一版本的243倍。通过单分子实时测序和人工验证在毛竹中鉴定出51 074个结构完整的高质蛋白质编码基因模型。此外,利用Illumina和Pacific Bioscience（PacBio）测序平台对毛竹26个不同代表性组织样本进行了大规模转录组测序,从中鉴定出25 225个可变剪接基因和266 711个特异的可变剪接事件,得到一个完整的可变剪接图谱。通过与近缘物种进行同源基因比较,发现可变剪接基因集中在表达水平高且组织特异性低的保守基因中,并发现在毛竹木质素生物合成途径关键基因中存在基因家族扩展、大量可变剪接事件和正向选择。本研究成果将为比较基因组学研究和深入分析基因可变剪接提供数据支持,也为研究可变剪接在竹子进化和多样化中的作用提供了一个全局视角。     

3种棕榈藤叶片叶绿素荧光特征分析研究

棕榈藤作为热带、亚热带植物中重要的森林资源,优质的藤材是重要的加工利用材料,具有重要的经济价值。叶片光合能力对藤材的形成具有重要影响,利用叶绿素荧光仪测定黄藤(Daemonorops jenkinsiana)、大白藤(Calamus faberii)、小白藤(C.balansaeanus)的叶绿素荧光参数,为研究逆境条件下棕榈藤的光合能力和选择适宜的栽培条件提供参考。结果表明,在实验室条件下3种棕榈藤的光系统Ⅰ(PSⅠ)实际光量子效率Y(Ⅰ)为小白藤 > 大白藤 > 黄藤,光系统Ⅱ(PSⅡ)的Y(Ⅱ)为大白藤 > 黄藤 > 小白藤;非光化学猝灭系数qN由高到低依次为大白藤、黄藤和小白藤;而光化学猝灭系数qP则是小白藤最高,黄藤次之,大白藤最低;PSⅠ的电子传递效率ETR(Ⅰ)是小白藤 > 大白藤 > 黄藤,而PSⅡ的ETR(Ⅱ)值则是小白藤 > 黄藤 > 大白藤;PSⅡ最大光量子产量F_v/F_m维持在0.78~0.8范围内,且大白藤显著高于黄藤和小白藤(P < 0.05)。由此可见,在实验室条件下小白藤的光合效率在这3种藤中最高,其次为黄藤,大白藤最低;且光保护能力为大白藤最高,黄藤次之,小白藤最低。