袋鼠疱疹病毒1型实时荧光PCR方法的建立

为实现袋鼠临床样本中疱疹病毒1型(Macropodid herpesvirus 1,MaHV-1)的出入境快速检测,基于MaHV-1的gB基因序列设计特异引物和TaqMan探针,建立了一种MaHV-1荧光PCR检测方法。试验结果显示,该方法只对MaHV-1 gB基因呈现特异性扩增,与禽传染性喉气管炎病毒、伪狂犬病毒和牛传染性鼻气管炎病毒不发生交叉反应,对阳性标准质粒对照(pCR-MaHV-1-gB)的最低检测限为8个拷贝数/反应。该方法的组内和组间试验的Ct值变异系数介于0.17%～0.96%之间,具有良好的重现性。试验结果表明,本研究建立的实时荧光PCR方法可用于袋鼠MaHV-1的病原学检测。     

A型猪流感病毒TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法的建立

根据A型猪流感病毒(SIV)的基质蛋白(M)编码基因保守序列设计合成一对特异性引物和一条Taq Man探针,建立了一种检测A型SIV的荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法对H1N1、H3N2和H9N2亚型SIV均呈特异性扩增,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒等猪的其他常见病毒无交叉扩增反应;该方法对M基因RNA对照(SIV-M-RNA)的最适线性检测范围为3.8×10~1~3.8×10~8拷贝数/反应,标准曲线方程为Y=-3.4365X+40.091,相关系数(R~2)为0.999 8,最低检出限为38个拷贝数的SIV-M-RNA。对3个不同浓度(3.8×10~3~3.8×10~5 copies/μL)的SIV-M-RNA进行组间和组内重复试验,每个浓度的Ct值变异系数均小于1.5%,具有良好的重现性。用该方法对860份进口猪的鼻拭子样本和78份国内猪场猪鼻拭子样本进行SIV检测,结果进口猪鼻拭子样本的SIV检测均为阴性,17份国内猪场猪鼻拭子样本SIV检测为阳性。本研究提供了一种快速、敏感和特异的A型猪流感病毒检测方法。     

活体动物中大环内脂类残留检测微生物抑制法的建立

[目的]建立活体动物中大环内酯类残留的检测方法。[方法]采用微生物抑制方法,对藤黄微球菌CMCC 28001的选择性和特异性、样品提取方法、平板制备条件、方法检出限等技术参数进行研究。[结果]建立的方法可用于活体动物中红霉素、泰乐菌素、螺旋霉素、林可霉素、吉他霉素和克林霉素等6种大环内脂类药物的残留检测。当菌悬液添加浓度为10~(-3)倍稀释液(5.5×106CFU/m L)以及培养基PH值为7.5且培养温度为30℃时,可产生直径最大,边缘光滑、完整、清晰的抑菌圈。[结论]该方法具有良好的敏感性和重复性,成本低,操作简便,是色谱分析、免疫分析等其它方法的有益补充。     

基因3型猪戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

对GenBank中基因3型猪戊型肝炎病毒(HEV)代表毒株基因进行序列分析,最终选定ORF3基因的部分序列为目的基因,运用生物信息学软件设计特异性引物和探针,扩增获得目的片段,并构建重组载体pUC-19-ORF3。梯度稀释重组质粒制备标准品,初步建立检测基因3型HEV的实时荧光定量PCR方法。对建立的检测方法进行特异性、敏感性和重复性验证。结果表明,标准品浓度在10~8~10~2 copies/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.996。特异性试验结果显示,其它几种常见猪病病原体(猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒)未见典型扩增曲线。敏感性试验证实本方法的最低检测下限为10~1 copies/μL。重复性试验表明该方法对3个标准品检测结果的批内和批间变异系数低于2%。用该方法抽检59份进境猪肉样品,同时用普通RT-PCR方法对这些样品进行符合性试验,结果均为阴性。本研究所建立的检测方法不仅适用于进境猪肉样品中基因3型HEV的监控检测,而且还可用于基因3型HEV的早期临床诊断及分子流行病学调查。     

H1和H3亚型猪流感病毒二重TaqMan-MGB探针荧光RT-PCR检测方法的建立

根据H1和H3亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)编码基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和Taq Man-MGB探针,建立了一种检测H1和H3亚型SIV的二重荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法仅对H1和H3亚型SIV呈特异性扩增,对H9亚型SIV、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(SFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)无交叉扩增反应;用该方法检测H1和H3亚型SIV的HA基因的RNA标准对照(SIV-H1-RNA,SIV-H3-RNA),最适线性检测范围分别为3.7×10~1~3.7×10~8拷贝数/反应和3.4×10~0~3.4×10~8拷贝数/反应,最低检出限分别为38和34个拷贝数;该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示其具有良好的可重复性。用该方法对520份进口猪的鼻拭子样本和78份国内猪鼻拭子样本进行SIV检测发现,进口猪鼻拭子样本的SIV检测结果均为阴性,12份国内猪鼻拭子样本的H1亚型SIV检测结果为阳性,5份国内猪鼻拭子样本的H3亚型SIV检测结果为阳性。本方法的建立为H1和H3亚型SIV检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。     

微流控芯片技术检测虾四种病原微生物方法的建立

针对虾的白斑综合征病毒、桃拉综合征病毒、黄头病毒和十足目虹彩病毒1的基因保守序列设计LAMP引物,将引物包被于芯片反应槽中,将微流控芯片技术与LAMP等温扩增技术相结合,建立针对这四种病毒的高效准确检测方法。用不同浓度的病毒阳性模板检测了建立的检测方法对4种虾病毒与另1种常见虾病毒的特异性,并对20份阳性和30份阴性虾组织样本的特异性、敏感性和重复性进行了临床对比验证实验。结果表明：本研究方法灵敏度高,特异性强,重复性好,各病毒间无交叉反应,为同时快速检测虾的四种病毒提供了技术手段。     

尼帕病毒与猪流感病毒双重荧光定量RT-PCR方法的建立

根据尼帕病毒(NiV)M基因和猪流感病毒(SIV)M基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种鉴别NiV和SIV的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法,对该方法的定量线性范围、敏感性、重复性和特异性进行了评价及初步应用。结果显示,用该方法检测NiV M基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA)和SIV M基因的RNA标准对照(SIV-M-RNA),定量线性范围分别为4.6×101copies/μL~4.6×108 copies/μL和5.8×101copies/μL~5.8×108 copies/μL,检出限分别为46个拷贝和58个拷贝。该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于1.6%,显示其良好的可重复性。该方法仅对NiV-M-RNA和SIV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒(CSFV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应。用该方法对236份猪的鼻拭子样品进行NiV和SIV的同时检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,有1份样本的SIV检测结果为阳性。本研究建立的方法可为猪临床样本中NiV和SIV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。