猫白介素-18基因的克隆、序列分析及其表达

用猫白介素18(interleukin,IL-18)基因特异性引物对刀豆蛋白(ConA)刺激后猫外周血单核细胞(PBMCf)总RNA进行了RT-PCR扩增,并将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定。结果该基因全长579bp,编码192个氨基酸(GenBank登录号:DQ100372)。在推导的猫IL-18氨基酸序列中,无信号肽序列和潜在的N-联糖基化位点,但存在4个Cys残基。与不同物种IL-18相比,猫IL-18与犬、羊、牛和猪IL-18核苷酸序列有较高的同源性,分别为89.8%、88.6%、88.4%和88.1%,但与小鼠和鸡IL-18有明显的种属差异。将目的基因片段进一步亚克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到分子量为27.5kD的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

不同宿主来源犬瘟热病毒的分离及致病相关基因序列分析

利用Vero-DST细胞从死亡犬、狐狸肺、脾内分离到4株犬瘟热病毒-CDV-TM-CC、CDV-Dog-SCh、CDV-Fox-SY、CDV-Fox-WF,在Vero-DST细胞上传5代没有细胞病变,5代细胞培养物经电镜、间接免疫荧光及PCR鉴定为阳性。与本实验室保存的CDV-Monkey-BJ进行基因测序,并对与致病相关的F蛋白、V蛋白进行分析,F蛋白分析5株毒具有6个潜在N-末端糖基化位点,与强毒株同源性在92%～99.7%,与疫苗株不高于93.3%,在F1亚基内有7个特有氨基酸位点,这可能与其对灵长类致病有关。V蛋白分析表明,其与强毒株同源性在94%～99.7%之间,而与疫苗株不高于93.3%,CDV-Monkey-BJ C272R突变使其Zn结合能力丧失。试验结果显示,所有分离株均为强毒株,不同宿主毒株序列存在差异,值得进一步研究。     

小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列的克隆及序列分析

本研究对军事兽医研究所病毒二室分离驯化后的小熊猫源犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)基因组进行全序列测定,并对其基因组特征及H基因遗传稳定性进行比较分析。根据GenBank公布的犬瘟热病毒全长基因组序列设计合成17对特异性引物,以小熊猫源犬瘟热病毒总RNA为模板,RT-PCR进行分段扩增,并克隆到pEASY-Blunt Simple载体中,经测序、拼接获得全长cDNA序列。结果显示,小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列与GenBank登录号分别为AF014953、AY445077、AY542312、AY466011、AY386316、AF164967、EU716337、EU726268、AY443350、AB474397、GU138403和AY649446的12个不同毒株全基因序列的同源性分别为86.6%、92.4%、92.5%、92.5%、94.3%、96.3%、95.9%、87.1%、94.5%、92.3%、87.4%和94.6%,与标准强毒株A75/17株(AF164967)的亲缘关系最近,全基因同源性达96.3%,但与疫苗株Onderstepoort(AF014953)亲缘关系相对较远,同源性为86.6%。小熊猫源犬瘟热病毒H基因与其他不同地区具有代表性的30株CDV进化树分析显示,小熊猫源犬瘟热病毒属于Asia Ⅰ型,H蛋白中309－311位氨基酸残基所形成的潜在糖基化位点,为疫苗株没有而野毒株所共有的,并且可能与病毒的免疫原性有关。因此,致弱的小熊猫源CDV在预防免疫的针对性上可能强于已有的疫苗株。     

基因序列分析鉴定犬冠状病毒分离株

采用双脱氧末端终止法测定了克隆于重组质粒YS1pUC、CI1pUC上的2株因内分离病毒CCV YS1、CI1部分纤突蛋白基因序列．以计算机软件推导氨基酸序列．进行核苷酸和氨基酸序列的多重比较。绘制系统进化树。分析重要抗原位点氨基酸残基的变化情况。预测蛋白质疏水性和二级结构。结果表明：重组质粒中含有571bp的外源基因。核苷酸和氨基酸序列与国外发表的K378等5株CCV相应序列的同源性分别为91．7％--99．4％和92．O％--99．4％。而与猪传染性胃肠炎病毒PUR46株和猫传染性腹膜炎病毒1146株的同源性为90．2％和88．O％--90．O％。A抗原的Ab亚住点上的氨基酸残基与备株CCV相同。不同于其他冠状病毒。由此进一步证明。2株国内分离病毒CCV YS1、CI1为犬冠状病毒。     

犬瘟热病毒反转录—聚合酶链反应检测方法的建立及初步应用

根据 Gen Bank中 Barrett报道的犬瘟热病毒弱毒株 Onderstepoort的血凝蛋白基因序列 ,设计合成了一对能扩增 76 0 bp基因片段的引物。用异硫氰酸胍 -酚 -仿一步抽提法提取细胞总 RNA进行反转录 ,再以此产物为模板进行 PCR扩增 ,筛选出最佳扩增条件。结果以此对引物进行 PCR扩增能得到与设计片段大小相同的产物 ,并且不扩增犬细小病毒、犬 I型腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒的核酸。敏感性试验证实 ,此法能扩增出稀释 1 0 0 0倍的 CDV强毒细胞培养物 ( 1 0 5 .1 TCID5 0 /0 .1 ml)的反转录产物 ,其敏感性远高于电镜负染和荧光抗体染色法。经初步应用表明 ,此法可用于犬瘟热的临床诊断和实验研究。     

果子狸细小病毒的分离与鉴定

用F81细胞从河南送检的患有肠炎的果子狸粪便样品中分离出一株病毒，经形态学、理化学、生物学和分子病毒学实验鉴定是一株CPV-2a的突变株。此毒株在F81细胞上生长，能产生CPV感染的特征性细胞病变，细胞肿胀、变圆、破碎、脱落；病毒粒子二十面体立体对称，直径为20～24nm；无囊膜，能抵抗氯仿的处理，耐酸，耐热，但能被5-IUDR抑制。可凝集猪红细胞，不凝集鸡、豚鼠、大鼠、兔、人“O”型红细胞，能被抗CPV抗体所抑制。设计特异性细小病毒引物扩增VP2基因的两个片段，并进行测序，分析结果表明，该毒株是在CPV-2a的基础上其VP2的第297位氨基酸发生A→S突变，第300位氨基酸发生G→S突变，第301位氨基酸发生T→A突变。该毒株暂定名为PV／GZL/H／1／02。该病毒能感染犬。     

犬细小病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

利用本实验室建立的昆虫细胞/杆状病毒表达系统表达犬细小病毒病毒样颗粒（CPV-VLPs）,采用硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心对表达的CPV-VLPs进行纯化,用电子显微镜、SDS-PAGE及Western-blotting方法检测纯化效果。以纯化的CPV-VLPs作为包被抗原建立CPV间接ELISA检测方法,对各反应条件进行优化并分析其特异性、敏感性、重复性。结果显示,CPV-VLPs经过纯化后纯度可达到95%以上;优化的ELISA最佳工作条件为：纯化抗原包被浓度为5.0mg/L,4℃包被过夜;1%BSA,37℃封闭2h;待检血清1∶40稀释,37℃孵育1.5h;HRP标记的酶标二抗1∶20 000稀释,37℃孵育1h;TMB室温避光显色30min;确定的血清阴性阳性临界值D450nm值为0.264。该方法可特异性检测犬细小病毒阳性血清,与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬冠状病毒病、狂犬病阳性血清均不发生反应。该方法的敏感性为1∶640,批内重复试验变异系数小于6%,批间重复试验变异系数小于8%。42份临床血清样本的检测结果表明,与血凝抑制试验的符合率为90.48%。     

猫泛白细胞减少症病毒的分离与鉴定

应用猫肾传代细胞(FK),采用同步接毒的方法,从8份狮、虎、豹病料中分得6株病毒,经与标准病毒作交叉免疫电镜等系统鉴定,证明与猫泛白细胞减少症病毒的特性基本相符,从而首次证实在我国动物园狮、虎、豹等猫科动物中存在猫泛白细胞减少症。     

应用致敏SPA菌体提高CAV/CPV PCR检出率的研究

为消除粪便等病料中的PCR干扰物质 ,提高犬腺病毒与细小病毒 (CAV CPV)联合PCR检出率。根据免疫吸附的原理 ,应用CAV CPV高免血清致敏含A蛋白的金黄色葡萄球菌 ,制成致敏SPA菌体免疫吸附剂 ;以此免疫吸附提取粪便等病料中的CAV/CPV ,然后直接或经 3 5mol/LMgCl2 将所吸附病毒洗脱后再做PCR。结果 8份经电镜负染或HA/HI试验验证为阳性的粪便样品 ,如此处理后进行PCR检测 ,结果均为阳性 ;而直接取粪便离心后用上清进行PCR检测 ,结果均为阴性。表明该法可有效去除待检样品中的PCR干扰物质 ,提高PCR的检出率。     

犬冠状病毒BEI灭活苗的制备与免疫试验

烷化剂类灭活剂是一类含烷基分子去一个氢原子 ( Cn H2 n 1)化合物 ,它能与另一种化合物作用 ,将烷基引入形成烷基取代物 ,根据其结构可分为氮芥类、乙烯亚胺类和磺酸脂类。这类化合物的化学性质活泼 ,其灭活机制主要在于烷化 DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤 ,引起单链断裂、双螺旋键交联 ,妨碍RNA的合成 ,从而抑制细胞分裂。另外 ,也可与微生物的酶系统和核酸蛋白起作用 ,干扰核酸的代谢 ,因此 ,这类灭活剂能破坏病毒的核酸 ,使其完全丧失感染力 ,但并不损害其蛋白质衣壳 ,得以保留其保护性抗原 ,故是制备灭活病毒疫苗较好的灭活剂。据报道…