过表达ZmIBH1-1提高玉米苗期抗旱性

【目的】干旱是严重影响玉米生长发育进程的一个重要因素。挖掘玉米抗旱相关基因,通过转基因功能验证和转录组分析,解析关键基因在响应干旱胁迫过程中的分子调控机制,为抗旱分子育种和遗传改良提供理论依据。【方法】以玉米自交系B104（WT）为背景材料,利用农杆菌介导方法构建过表达ZmIBH1-1转基因株系（ZmIBH1-1-OE）;通过对转基因植株进行草铵膦抗性筛选、标记基因和目的基因PCR检测,以及运用实时荧光定量PCR检测目的基因的表达情况,鉴定阳性植株和株系;以WT和ZmIBH1-1-OE转基因株系为材料,通过干旱处理（20% PEG6000）,进行表型鉴定和耐旱生理生化指标测定,验证ZmIBH1-1的抗旱功能;通过对干旱胁迫下玉米4叶期转录组的比较分析,鉴定出差异表达的基因（differentially expressed genes,DEGs）;结合DAP-seq（DNA affinity purification sequencing）分析,初步确定ZmIBH1-1蛋白直接调控与抗旱相关的下游靶基因,利用基因组可视化软件IGV（integrative genomics viewer）分析ZmIBH1-1蛋白结合候选靶基因的位置,然后通过Dual-Luciferase试验验证ZmIBH1-1蛋白与靶基因的调控关系。【结果】通过玉米遗传转化获得12个转化事件;T₃代中,能同时检测到标记基因Bar和目的基因ZmIBH1-1的植株有458个,实时荧光定量PCR检测结果表明,ZmIBH1-1-OE中ZmIBH1-1的表达量显著高于WT,株系3和株系8表达量最高,将其自交获得T₄代转基因株系用于后续试验。在干旱胁迫条件下,ZmIBH1-1-OE株系存活率、叶片相对含水量、叶绿素含量、可溶性蛋白含量及其生理生化指标（超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性）均显著高于WT,说明玉米中过量表达ZmIBH1-1赋予玉米更高的耐旱性。转录组分析结果表明,WT与ZmIBH1-1-OE株系在干旱胁迫下有1 214个差异表达基因;Gene Ontology（GO）功能富集分析结果表明,差异表达基因主要涉及生物过程、细胞组分和分子功能,如在生物过程中主要涉及到光合作用、应激响应、脱水响应等;KEGG富集分析表明,差异表达基因主要参与植物激素信号传导、新陈代谢等过程。结合转录组显著差异表达基因和DAP-Seq分析所得到ZmIBH1-1蛋白的靶基因,初步确定ZmIBH1-1蛋白直接调控与抗旱相关的11个候选靶基因,包括2个钙信号相关基因、3个半胱氨酸代谢相关基因、1个bHLH转录因子、1个应激响应蛋白、1个谷胱甘肽转移酶、1个氧化还原过程蛋白和2个乙烯响应因子;基因组可视化结果显示ZmIBH1-1蛋白可以结合靶基因启动子区;随后通过Dual-Luciferase试验进一步表明,ZmIBH1-1蛋白可以直接作用于11个候选靶基因,其中,ZmIBH1-1蛋白可以促进ZmCa-M、ZmSYCO、ZmbHLH54、ZmGlu-r1、ZmCLPB3和ZmP450-99A2的表达,抑制ZmAGD12、ZmCYS、ZmCYSB、ZmERF-107和ZmEIN3的表达。此外,在干旱胁迫下NAC、WRKY、MYB等转录因子在ZmIBH1-1-OE和WT株系中也存在差异表达。【结论】ZmIBH1-1的过表达可以增强玉米苗期的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白通过直接调控乙烯信号通路中的ZmERF-107和ZmEIN3的表达提高玉米的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白通过直接调控钙信号相关基因ZmCa-M和ZmAGD12增强玉米的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白可能通过间接调控NAC、WRKY、MYB等转录因子响应干旱胁迫。     

普通小麦主要农艺性状的全基因组关联分析

为解析小麦复杂农艺性状的遗传机制,本研究以150份小麦品种(系)为自然群体,在4个环境条件下测定了9个主要农艺性状,利用小麦35K SNP芯片,结合5种关联模型(Q、PCA、K、PCA+K、Q+K),进行全基因组关联分析。结果表明,全基因组多态性信息量PIC的范围为0.0950～0.5000,最小等位基因频率MAF值为0.0500～0.5000;群体结构分析和PCA分析均表明参试材料可分为两个亚群;连锁不平衡分析发现A基因组、B基因组、D基因组和全基因组的LD衰减距离分别为4.7、8、11和6 Mb。9个性状共检测到652个显著的关联位点(P≤0.001),其中21个SNP在2个或2个以上的环境中被重复检测到,分布在1A(1)、1B(4)、2A(3)、2D(2)、3A(1)、5A(1)、5B(5)、6A(1)、6B(2)和7D(3)染色体上; 1个SNP标记的物理位置未知, 3个SNP标记同时与2个性状显著关联;单个SNP的表型贡献率为7.67%～18.79%。8个优势等位变异在供试群体中所占比例较低,筛选出14个可能与小麦农艺性状相关的候选基因,其中TraesCS5B02G237200、TraesCS7D02G129700和TraesCS1B02G426300可能在植物抵御生物与非生物胁迫中起作用,TraesCS5B02G010800和TraesCS7D02G436800可能与植物激素的合成和响应有关,TraesCS2A02G092200可能与植物细胞壁的增强有关, TraesCS5A02G438800可能参与叶绿体发育,另外7个候选基因的功能未知。     

玉米pTAC2影响苗期叶片叶绿素合成的转录组分析

【目的】叶绿素是参与光合途径最为重要的光合色素。叶绿体的发育及叶绿素的合成在很大程度上依赖于质体基因组与核基因组之间的双向信号传导来精确协调基因表达。通过对白化表型的CRISPR/Cas9-ZmpTAC2转基因阳性纯合突变材料进行RNA-seq研究,筛选和鉴定参与叶绿素合成的相关基因,为明确叶绿素的合成途径奠定基础。【方法】以CRISPR/Cas9-ZmpTAC2玉米转基因编辑纯合突变株系为研究材料,使用透射电镜观察叶绿体超微结构和分光光度法测定叶片叶绿素含量,确定叶绿体发育状态及叶绿素合成情况。对转基因阴性材料（CK）和CRISPR/Cas9-ZmpTAC2转基因纯合编辑材料（zmptac2）苗期叶片取样进行转录组测序。通过生物信息学分析,寻找CK与zmptac2间差异表达的基因;qRT-PCR对差异表达基因进行验证。通过酵母双杂交筛选与玉米pTAC2互作的蛋白质。【结果】共获得15株T₀转基因植株,包括绿色植株（7株）和白色植株（8株）。绿色幼苗中3株为转基因阴性材料,4株为转基因阳性（2株为未编辑,2株为杂合编辑突变）,白色植株(8株)均为转基因阳性纯合编辑。与CK相比,突变体（zmptac2）叶绿体发异常,叶绿素含量显著降低。RNA-seq的结果显示,CK与zmptac2之间共检测到1 367个基因差异表达,其中618个基因上调表达（zmptac2/CK）,749个基因下调表达（zmptac2/CK）。GO富集分析显示,下调基因显著富集到叶绿体和质体中。KEGG分析表明下调表达基因显著富集在苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢和异喹啉生物碱生物合成等途径。选取的15个差异基因表达模式均与测序数据相一致,表明测序结果是可靠的。与CK相比,zmptac2中依赖PEP（plastid-encoded RNA polymerase）转录的基因表达量显著降低,而依赖NEP（nuclear gene-encoded RNA polymerase）转录的基因表达量则显著上升。通过对玉米cDNA文库筛选和互作验证,鉴定出ZmpTAC3与ZmpTAC2存在互作。【结论】ZmpTAC2突变会导致叶绿体早期生物合成受阻,该基因参与叶绿体发育及叶绿素合成,且该种作用是由ZmpTAC2调控PEP相关基因表达而实现的。     

PEG-6000模拟干旱胁迫下不同基因型 小麦品种萌发期抗旱性的综合鉴定

为了研究不同基因型小麦品种萌发期的抗旱性,以20个小麦品种为材料,采用质量分数为20%的PEG-6000溶液处理模拟干旱胁迫,测定了芽长、主胚根长、芽鲜质量、根鲜质量、发芽率、发芽势、发芽指数和萌发抗旱指数等指标,通过主成分分析和综合评价值(F值)法对供试材料的抗旱性进行综合评价,并通过测定相关生理指标对评价结果进行了验证。结果表明,PEG-6000胁迫处理后的芽长、主胚根长、芽鲜质量、根鲜质量、发芽率、发芽势、发芽指数均受到抑制,但不同品种的降幅存在显著差异。主成分分析表明,晋麦47、运旱618、长治6406、石4185和旱选10号抗旱性明显强于F值较低的京冬18、石家庄4号、石优20、郑麦366和郑麦9023。相关生理指标测定结果表明,F值较高的晋麦47、运旱618和长治6406的抗旱性要显著高于F值较低的京冬、石家庄4号和郑麦366。这说明基于形态指标的综合评价值法可以有效地对小麦萌发期抗旱性进行鉴定,供试材料中抗旱性较强的品种有:晋麦47、运旱618、长治6406、石4185和旱选10号,抗旱性较差的品种有:京冬18、石家庄4号、石优20、郑麦9023和郑麦366。     

TaHIPP32与 TaHAK1表达及小麦缺钾胁迫耐性的关系

钾是植物生长发育必需的三大营养元素之一。高亲和性钾转运蛋白（HAK）能加强植物在缺钾胁迫时钾的吸收和转运。本课题组前期研究发现，小麦 TaHAK1基因在缺钾胁迫条件下显著上调表达，并筛选得到可能调控 TaHAK1基因表达的上游转录因子基因 TaHIPP32，但这两个基因在缺钾胁迫中的作用机制尚不清楚。本研究首先对 TaHIPP32基因进行了系统发育和亚细胞定位分析，然后利用双荧光素酶验证 TaHIPP32和 TaHAK1基因的互作，并以河南省大面积推广的小麦品种百农207为试验材料，利用大麦条纹花叶病毒诱导基因沉默（BSMV-VIGS）技术分析缺钾胁迫处理下 TaHIPP32基因沉默对小麦植株的影响。系统发育和亚细胞定位分析表明， TaHIPP32基因与水稻 OsHIPP33基因的亲缘关系最近，且其编码的蛋白定位于细胞膜上。双荧光素酶试验表明，TaHIPP32蛋白能够与 TaHAK1基因启动子互作。通过BSMV-VIGS技术瞬时沉默 TaHIPP32基因，发现该基因沉默后，小麦植株对缺钾胁迫更为敏感，植株生长受到抑制，干重显著降低，丙二醛(MDA)含量显著提高；缺钾胁迫处理下，沉默 TaHIPP32基因的植株中， TaHAK1和 TaHIPP32基因的表达均被抑制，且植株体内钾元素从地下部到地上部的转移系数显著降低，说明 TaHIPP32基因通过调节 TaHAK1基因的表达来影响植株体内钾元素的转运。     

Physiological effects of different Cd concentrations on maize root architecture and classification北大核心CSCD

In this research, a hydroponics experiment was conducted to apply different concentrations of cadmium (Cd) (0, 5, 10, 25, 50, 100, 200 μmol·L-1) to maize seedlings with two leaves and one new leaf, in order to explore the effects of the different Cd concentrations on the maize seedling growth, Cd absorption kinetics and root morphology and classification. After 5 days of Cd stress, the maize seedings were sampled, the plant height, main root length, aboveground and underground biomass, root architecture, Cd content and photosynthesis and related parameters were measured. It was found that with increasing Cd stress, the plant height, main root length, biomass and tolerance index of shoots and roots, total root length, root surface area, root volume, root forks and root tips all decreased significantly; Root average diameter and root:shoot increased significantly (P<0.05). Meanwhile root parameters (root length, root surface area and root volume) of root diameter classes designated Ⅰ-Ⅲ (0-1.5 mm) showed a decreasing trend, which had a significant (P<0.05) negative correlation with root Cd concentration. The proportion of root length, root surface area and root volume with diameter between 0-0.5 mm showed a downward trend under Cd stress. Under Cd stress, Cd concentration and accumulation in underground and aboveground parts of maize seedlings increased significantly, chlorophyll content decreased, and photosynthesis was inhibited. This study has shown that Cd affected root development mainly by inhibiting the growth and morphology of fine roots, and inhibited photosynthesis, elongation and biomass accumulation of the aboveground and underground parts of the maize seedings. © 2022, Editorial Office of Acta Prataculturae Sinica. All rights reserved.     

采用立方体取样法提高小麦根系研究精准性的探讨

为减少取样误差,提高小麦根系研究的精准性,于2018-2020年分别采用立方体取样法(CSM)、根钻法(CK1)、挖掘法(CK2)对西农979、周麦27进行不同生育时期不同土层根系生长发育和活性的比较研究.结果表明,相较于CK1和CK2处理,CSM处理的根干质量、根长、根表面积和根体积测定值较高,20～40cm 土层中不同处理上述指标测定值的差异大于0～20 cm 土层,且在生育后期不同取样方法上述指标测定值之间差异较大.相较于CK1和CK2处理,CSM处理的根系活性测定值较高,通过不同取样方法测定的根系活性差异较大,尤其是在生育前期,而生育后期差异缩小;全生育期不同土层中根系活性的差异较大,表现为0～20 cm 土层高于20～40 cm 土层,而20～40 cm 土层中不同取样方法下根系活性测定值的差异大于0～20 cm 土层.相关性和回归分析结果表明,不同土层中不同取样方法根系性状测定值间呈极显著正相关;通过回归方程的建立,可根据CK1、CK2处理的根系性状测定值估算CSM处理根系性状测定值,从而对CK1、CK2的测定值进行矫正.,比较而言,立方体取样法虽然操作要求高,但获取的根样代表性强,根系性状调查分析精准度高、误差小.     

小麦籽粒大小相关基因TaGS2克隆及功能分析

籽粒大小影响小麦粒重,进而影响产量。目前,对小麦籽粒大小相关基因的研究已有报道,但其潜在的分子机制尚不清楚。本研究通过同源克隆的方法从普通小麦中克隆了小麦籽粒大小相关基因TaGS2,并对其序列进行生物信息学分析。烟草亚细胞定位结果表明, TaGS2定位在细胞核和细胞质内。不同组织材料qRT-PCR分析表明, TaGS2基因在小麦籽粒不同发育时期的表达量最高。构建TaGS2-PLGY-02-RNAi表达载体,转化小麦。研究结果表明, TaGS2基因在RNAi转基因小麦中表达量显著降低。RNAi转基因小麦的籽粒长度变短,籽粒宽度变窄,千粒重也降低。因此推测TaGS2基因可能参与小麦籽粒大小或者千粒重的调控。本研究初步揭示了TaGS2基因功能,并为小麦高产育种中千粒重的提高提供重要的基因资源。     

小麦根中NADP-脱氢酶系统关键酶活性与根系活力和产量的关系分析

【目的】在黄淮平原典型农田氮肥减施条件下,探索决定小麦根系活力的关键脱氢酶种类及酶活性变化及其对籽粒产量的影响。【方法】采用大田试验方式,运用裂区设计,主处理为施氮量,设0（N0）,135（N1）,157.5（N2）,180（N3）,202.5（N4）,225（N5）kg·hm^-2 6个施氮水平,副处理为半冬性品种矮抗58和周麦27号。对小麦越冬期、返青期、拔节期、挑旗抽穗期、灌浆期和蜡熟期根中异柠檬酸脱氢酶（NADP-ICDH）、NADP-苹果酸酶（NADP-ME）、戊糖磷酸途径总脱氢酶（G6PDH+6PGDH）活性与根系活力（改良TTC法）和产量间的关系进行分析。【结果】小麦关键生育时期根系活力呈“高-低-高-低”变化,NADP-ICDH,NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）活性变化均表现为先上升后下降的趋势,灌浆后活性变化不明显。越冬前后,不同施氮处理间根中NADP-脱氢酶系统关键酶活性表现为不施氮处理（N0）大于施氮处理（N1-N5）;拔节-抽穗期,NADP-脱氢酶系统关键酶活性和根系活力均表现为施氮处理（N1-N5）显著高于不施氮（N0）处理,随着施氮水平逐步降低不同酶活性随之降低,与N5处理相比,N4处理NADP-ICDH和NADP-ME的活性未达显著水平,同时（G6PDH+ 6PGDH）活性和根系活力降幅最少。施氮量显著影响小麦籽粒产量及其构成因素,与不施氮处理（N0）相比,施氮处理（N1-N5）下的单位面积成穗数、穗粒数显著提高。综合两年度产量平均值可知,N5处理下籽粒产量最高,达9 238.02 kg·hm^-2,N4处理次之,较N5处理仅下降0.3%且差异未达显著水平。进一步分析表明,不同生育时期根中NADP-ICDH、NADP-ME与（G6PDH+6PGDH）三者之间呈显著或极显著正相关关系;NADP-脱氢酶系统关键酶活性与根系活力呈正相关关系,其中生育中、后期达显著或极显著水平;根系活力及NADP-ICDH,NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）活性与产量呈显著或极显著正相关关系。通径分析表明,两年度NADP-ICDH,NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）活性在拔节期和挑旗抽穗期对产量有较大的正向作用;挑旗抽穗期根系活力对产量的直接作用较小,但其通过NADP-ME和戊糖磷酸途径总脱氢酶（G6PDH+6PGDH）活性对产量所产生的间接正向作用较大,因而根系活力对产量的影响达极显著水平。【结论】本试验条件下,综合考虑NADP-脱氢酶系统关键酶活性和根系活力变化及籽粒产量表现,黄淮平原麦田施氮水平由N5减至N4水平当是最佳选择。NADP-ICDH,NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）活性与采用改良TTC法测定的“根系活力”密切相关,其中NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）活性对根系活力影响最大,实践中可通过分子育种手段和有效栽培措施实现NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）在根中的高表达以提高小麦根系活力。