过表达ZmIBH1-1提高玉米苗期抗旱性

【目的】干旱是严重影响玉米生长发育进程的一个重要因素。挖掘玉米抗旱相关基因,通过转基因功能验证和转录组分析,解析关键基因在响应干旱胁迫过程中的分子调控机制,为抗旱分子育种和遗传改良提供理论依据。【方法】以玉米自交系B104（WT）为背景材料,利用农杆菌介导方法构建过表达ZmIBH1-1转基因株系（ZmIBH1-1-OE）;通过对转基因植株进行草铵膦抗性筛选、标记基因和目的基因PCR检测,以及运用实时荧光定量PCR检测目的基因的表达情况,鉴定阳性植株和株系;以WT和ZmIBH1-1-OE转基因株系为材料,通过干旱处理（20% PEG6000）,进行表型鉴定和耐旱生理生化指标测定,验证ZmIBH1-1的抗旱功能;通过对干旱胁迫下玉米4叶期转录组的比较分析,鉴定出差异表达的基因（differentially expressed genes,DEGs）;结合DAP-seq（DNA affinity purification sequencing）分析,初步确定ZmIBH1-1蛋白直接调控与抗旱相关的下游靶基因,利用基因组可视化软件IGV（integrative genomics viewer）分析ZmIBH1-1蛋白结合候选靶基因的位置,然后通过Dual-Luciferase试验验证ZmIBH1-1蛋白与靶基因的调控关系。【结果】通过玉米遗传转化获得12个转化事件;T₃代中,能同时检测到标记基因Bar和目的基因ZmIBH1-1的植株有458个,实时荧光定量PCR检测结果表明,ZmIBH1-1-OE中ZmIBH1-1的表达量显著高于WT,株系3和株系8表达量最高,将其自交获得T₄代转基因株系用于后续试验。在干旱胁迫条件下,ZmIBH1-1-OE株系存活率、叶片相对含水量、叶绿素含量、可溶性蛋白含量及其生理生化指标（超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性）均显著高于WT,说明玉米中过量表达ZmIBH1-1赋予玉米更高的耐旱性。转录组分析结果表明,WT与ZmIBH1-1-OE株系在干旱胁迫下有1 214个差异表达基因;Gene Ontology（GO）功能富集分析结果表明,差异表达基因主要涉及生物过程、细胞组分和分子功能,如在生物过程中主要涉及到光合作用、应激响应、脱水响应等;KEGG富集分析表明,差异表达基因主要参与植物激素信号传导、新陈代谢等过程。结合转录组显著差异表达基因和DAP-Seq分析所得到ZmIBH1-1蛋白的靶基因,初步确定ZmIBH1-1蛋白直接调控与抗旱相关的11个候选靶基因,包括2个钙信号相关基因、3个半胱氨酸代谢相关基因、1个bHLH转录因子、1个应激响应蛋白、1个谷胱甘肽转移酶、1个氧化还原过程蛋白和2个乙烯响应因子;基因组可视化结果显示ZmIBH1-1蛋白可以结合靶基因启动子区;随后通过Dual-Luciferase试验进一步表明,ZmIBH1-1蛋白可以直接作用于11个候选靶基因,其中,ZmIBH1-1蛋白可以促进ZmCa-M、ZmSYCO、ZmbHLH54、ZmGlu-r1、ZmCLPB3和ZmP450-99A2的表达,抑制ZmAGD12、ZmCYS、ZmCYSB、ZmERF-107和ZmEIN3的表达。此外,在干旱胁迫下NAC、WRKY、MYB等转录因子在ZmIBH1-1-OE和WT株系中也存在差异表达。【结论】ZmIBH1-1的过表达可以增强玉米苗期的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白通过直接调控乙烯信号通路中的ZmERF-107和ZmEIN3的表达提高玉米的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白通过直接调控钙信号相关基因ZmCa-M和ZmAGD12增强玉米的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白可能通过间接调控NAC、WRKY、MYB等转录因子响应干旱胁迫。     

玉米叶片表皮蜡质相关性状的全基因组关联分析

为发掘玉米叶片表皮蜡质合成与调控相关基因，以218份由温带、亚热带和热带自交系组成的关联群体为材料，在原阳对其3个生物学重复叶片表皮挂水能力进行调查，利用1.25 M覆盖玉米全基因组的SNPs进行Q、K和Q+K这3种模型下的全基因组关联分析。结果表明，Q模型较K模型和Q+K模型能更好地评价叶片表皮的挂水能力。Q模型下，共检测到88个覆盖玉米9条染色体的显著SNPs（P ≤ 2.04E-6），88个SNPs分布于47个QTLs内，单个QTL可解释13.6%~45.6%的叶片挂水能力表型变异，47个QTL内共有97个候选基因，其中，77个具有功能注释。位于第2染色体上的转录因子NAC77（GRMZM2G018436）和第3条染色体上的亚油酸酯氧合酶（GRMZM2G156861）编码基因，是叶片表皮蜡质性状的重要候选基因。     

玉米pTAC2影响苗期叶片叶绿素合成的转录组分析

【目的】叶绿素是参与光合途径最为重要的光合色素。叶绿体的发育及叶绿素的合成在很大程度上依赖于质体基因组与核基因组之间的双向信号传导来精确协调基因表达。通过对白化表型的CRISPR/Cas9-ZmpTAC2转基因阳性纯合突变材料进行RNA-seq研究,筛选和鉴定参与叶绿素合成的相关基因,为明确叶绿素的合成途径奠定基础。【方法】以CRISPR/Cas9-ZmpTAC2玉米转基因编辑纯合突变株系为研究材料,使用透射电镜观察叶绿体超微结构和分光光度法测定叶片叶绿素含量,确定叶绿体发育状态及叶绿素合成情况。对转基因阴性材料（CK）和CRISPR/Cas9-ZmpTAC2转基因纯合编辑材料（zmptac2）苗期叶片取样进行转录组测序。通过生物信息学分析,寻找CK与zmptac2间差异表达的基因;qRT-PCR对差异表达基因进行验证。通过酵母双杂交筛选与玉米pTAC2互作的蛋白质。【结果】共获得15株T₀转基因植株,包括绿色植株（7株）和白色植株（8株）。绿色幼苗中3株为转基因阴性材料,4株为转基因阳性（2株为未编辑,2株为杂合编辑突变）,白色植株(8株)均为转基因阳性纯合编辑。与CK相比,突变体（zmptac2）叶绿体发异常,叶绿素含量显著降低。RNA-seq的结果显示,CK与zmptac2之间共检测到1 367个基因差异表达,其中618个基因上调表达（zmptac2/CK）,749个基因下调表达（zmptac2/CK）。GO富集分析显示,下调基因显著富集到叶绿体和质体中。KEGG分析表明下调表达基因显著富集在苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢和异喹啉生物碱生物合成等途径。选取的15个差异基因表达模式均与测序数据相一致,表明测序结果是可靠的。与CK相比,zmptac2中依赖PEP（plastid-encoded RNA polymerase）转录的基因表达量显著降低,而依赖NEP（nuclear gene-encoded RNA polymerase）转录的基因表达量则显著上升。通过对玉米cDNA文库筛选和互作验证,鉴定出ZmpTAC3与ZmpTAC2存在互作。【结论】ZmpTAC2突变会导致叶绿体早期生物合成受阻,该基因参与叶绿体发育及叶绿素合成,且该种作用是由ZmpTAC2调控PEP相关基因表达而实现的。     

穗期高温对玉米子粒灌浆生理及产量的影响

为揭示玉米穗期高温胁迫对子粒灌浆生理及产量的影响,以耐热型玉米品种郑单958和热敏感型玉米品种先玉335为试验材料,研究了第9片叶完全展开至抽雄期高温对玉米子粒灌浆特性、淀粉合成酶活性、激素含量和产量的影响。结果表明,穗期高温处理,郑单958和先玉335的产量分别比对照降低了11.14%和25.40%;2个品种的粒重和灌浆前期的灌浆速率降低,到达最大灌浆速率的时间延迟,灌浆速率最大时的生长量减小,活跃灌浆期延长;灌浆前期子粒淀粉合成酶活性降低;高温对先玉335的影响明显高于对郑单958。高温处理后,2个品种子粒中的生长素、玉米素核苷和赤霉素含量变化趋势一致,均表现为灌浆初期降低,灌浆后期升高,脱落酸含量表现则相反。     

TaHIPP32与 TaHAK1表达及小麦缺钾胁迫耐性的关系

钾是植物生长发育必需的三大营养元素之一。高亲和性钾转运蛋白（HAK）能加强植物在缺钾胁迫时钾的吸收和转运。本课题组前期研究发现，小麦 TaHAK1基因在缺钾胁迫条件下显著上调表达，并筛选得到可能调控 TaHAK1基因表达的上游转录因子基因 TaHIPP32，但这两个基因在缺钾胁迫中的作用机制尚不清楚。本研究首先对 TaHIPP32基因进行了系统发育和亚细胞定位分析，然后利用双荧光素酶验证 TaHIPP32和 TaHAK1基因的互作，并以河南省大面积推广的小麦品种百农207为试验材料，利用大麦条纹花叶病毒诱导基因沉默（BSMV-VIGS）技术分析缺钾胁迫处理下 TaHIPP32基因沉默对小麦植株的影响。系统发育和亚细胞定位分析表明， TaHIPP32基因与水稻 OsHIPP33基因的亲缘关系最近，且其编码的蛋白定位于细胞膜上。双荧光素酶试验表明，TaHIPP32蛋白能够与 TaHAK1基因启动子互作。通过BSMV-VIGS技术瞬时沉默 TaHIPP32基因，发现该基因沉默后，小麦植株对缺钾胁迫更为敏感，植株生长受到抑制，干重显著降低，丙二醛(MDA)含量显著提高；缺钾胁迫处理下，沉默 TaHIPP32基因的植株中， TaHAK1和 TaHIPP32基因的表达均被抑制，且植株体内钾元素从地下部到地上部的转移系数显著降低，说明 TaHIPP32基因通过调节 TaHAK1基因的表达来影响植株体内钾元素的转运。     

不同种质玉米自交系种子萌发的干旱胁迫研究

种子萌发期被认为是作物生长的关键时期,也是衡量作物耐旱性强弱的重要时期。为了明确不同玉米自交系的耐旱性,本研究采用聚乙二醇(PEG)模拟干旱条件,对254份不同种质玉米自交系进行种子萌发期处理。通过检测发芽指数、发芽率、根数、根鲜重、根干重、茎鲜重、茎干重、根长、苗高等种子发芽性状,以其相对值为指标,鉴定不同自交系种子萌发期的耐旱性。结果表明,在5%PEG6000浓度胁迫时,种子萌发程度低,当PEG浓度为10%时,种子萌发受抑制程度较高；各性状相对指标都与品种综合抗旱能力呈显著或极显著正相关；不同自交系的耐旱性存在较大差异,通过隶属函数法结合抗旱分级标准筛选出99份中等耐旱材料。因此,该方法可以作为一种简单的玉米自交系萌发期耐旱性鉴定方法。     

增施有机肥对夏玉米物质生产及土壤特性的影响

2015和2016年在大田试验条件下,研究不施肥(CK)、常规施肥(NPK)、常规施肥+有机肥(增施鸡粪1 500 kg/hm~2,NPKM)对夏玉米物质生产及土壤特性的影响。结果表明,与CK相比,NPK和NPKM处理2015和2016年玉米产量分别增加13.62%和18.61%、36.75%和44.93%。植株叶片SPAD值、植株根系和地上部生物量均表现为NPKMNPKCK。与CK相比,增施有机肥后,土壤呼吸、硝态氮、铵态氮含量、脲酶、蔗糖酶活性均显著增高,过氧化氢酶活性降低。相关分析表明,连续两年玉米子粒产量均与拔节期、吐丝期、成熟期的SPAD值和硝态氮含量呈显著正相关,与吐丝期和成熟期的根系生物量、地上部生物量、蔗糖酶活性呈显著正相关。     

小麦根中NADP-脱氢酶系统关键酶活性与根系活力和产量的关系分析

【目的】在黄淮平原典型农田氮肥减施条件下,探索决定小麦根系活力的关键脱氢酶种类及酶活性变化及其对籽粒产量的影响。【方法】采用大田试验方式,运用裂区设计,主处理为施氮量,设0（N0）,135（N1）,157.5（N2）,180（N3）,202.5（N4）,225（N5）kg·hm^-2 6个施氮水平,副处理为半冬性品种矮抗58和周麦27号。对小麦越冬期、返青期、拔节期、挑旗抽穗期、灌浆期和蜡熟期根中异柠檬酸脱氢酶（NADP-ICDH）、NADP-苹果酸酶（NADP-ME）、戊糖磷酸途径总脱氢酶（G6PDH+6PGDH）活性与根系活力（改良TTC法）和产量间的关系进行分析。【结果】小麦关键生育时期根系活力呈“高-低-高-低”变化,NADP-ICDH,NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）活性变化均表现为先上升后下降的趋势,灌浆后活性变化不明显。越冬前后,不同施氮处理间根中NADP-脱氢酶系统关键酶活性表现为不施氮处理（N0）大于施氮处理（N1-N5）;拔节-抽穗期,NADP-脱氢酶系统关键酶活性和根系活力均表现为施氮处理（N1-N5）显著高于不施氮（N0）处理,随着施氮水平逐步降低不同酶活性随之降低,与N5处理相比,N4处理NADP-ICDH和NADP-ME的活性未达显著水平,同时（G6PDH+ 6PGDH）活性和根系活力降幅最少。施氮量显著影响小麦籽粒产量及其构成因素,与不施氮处理（N0）相比,施氮处理（N1-N5）下的单位面积成穗数、穗粒数显著提高。综合两年度产量平均值可知,N5处理下籽粒产量最高,达9 238.02 kg·hm^-2,N4处理次之,较N5处理仅下降0.3%且差异未达显著水平。进一步分析表明,不同生育时期根中NADP-ICDH、NADP-ME与（G6PDH+6PGDH）三者之间呈显著或极显著正相关关系;NADP-脱氢酶系统关键酶活性与根系活力呈正相关关系,其中生育中、后期达显著或极显著水平;根系活力及NADP-ICDH,NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）活性与产量呈显著或极显著正相关关系。通径分析表明,两年度NADP-ICDH,NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）活性在拔节期和挑旗抽穗期对产量有较大的正向作用;挑旗抽穗期根系活力对产量的直接作用较小,但其通过NADP-ME和戊糖磷酸途径总脱氢酶（G6PDH+6PGDH）活性对产量所产生的间接正向作用较大,因而根系活力对产量的影响达极显著水平。【结论】本试验条件下,综合考虑NADP-脱氢酶系统关键酶活性和根系活力变化及籽粒产量表现,黄淮平原麦田施氮水平由N5减至N4水平当是最佳选择。NADP-ICDH,NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）活性与采用改良TTC法测定的“根系活力”密切相关,其中NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）活性对根系活力影响最大,实践中可通过分子育种手段和有效栽培措施实现NADP-ME和（G6PDH+6PGDH）在根中的高表达以提高小麦根系活力。     

氮肥水平对限制灌溉下冬小麦旗叶光合性能及产量的影响

为了解氮素营养供应与小麦节水效果的关系,以周麦22为材料,采取大田试验研究了不同氮肥水平对限制灌条件下冬小麦旗叶光合性能及产量的影响。结果发现,与正常灌水相比,限制灌溉降低了小麦旗叶叶绿素含量、净光合速率、气孔导度和蒸腾速率,提高了小麦旗叶胞间CO2浓度;限制灌溉条件下,与不施氮肥相比,增施氮肥能明显改善小麦旗叶光合性能。从产量来看,充分灌水有利于小麦产量提高,而限制灌溉条件下,灌水时期提前或增施氮肥能不同程度提高小麦产量。以上结果说明,增施一定量的氮肥能明显改善限制灌溉条件下冬小麦花后旗叶光合性能,提高小麦产量和水分利用效率。