牛奶中AFM1人工抗原的合成及多克隆抗体血清的制备

本研究合成并鉴定了黄曲霉毒素M1人工抗原,通过动物免疫制备出敏感性高、特异性好的鼠源黄曲霉毒素M1多克隆抗血清。采用琥珀酸酐改造黄曲霉毒素M1,并将其改造物按两种方法(DCC和EDC)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联,合成免疫抗原AFM1-BSA和检测抗原AFM1-OVA,经过薄层色谱、紫外扫描和凝胶电泳鉴定后,免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,每次间隔3周,最后1次免疫10d后,断尾采血,制备多抗血清。经过测定,免疫的3只小鼠效价均达到了1:104以上,2号小鼠多抗血清的敏感性最好,半数抑制浓度IC50(50%inhibitive concentration,IC50)为37.61ng/m L,且具有良好的特异性。本研究成功合成了黄曲霉毒素M1人工抗原和多克隆抗体血清,为黄曲霉毒素M1单克隆抗体制备及其免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

Cloning,Expression of Clostridium perfringens α-toxin Gene and Preparation of its Antisera

One pair of primers had been designed and synthesized based on the α-toxin gene of Clostridium perfringens.The complete α-toxin gene fragment was amplified by polymerase chain reaction (PCR), and then was cloned into pGEM-T Easy vector to construct pGEM-T-α.Digested with EcoRⅠ and Hind Ⅲ, a fragment of 1125 bp was cloned into the expression plasmid vector pET-28a(+).The recombinant plasmid was transformed into the BL21(DE3)plys and induced by 1.0 mmol/L IPTG at 37 ℃.The expression product was found to be 46.1 ku as expected one identified by SDS-PAGE, and confirmed by Western blotting with Clostridium perfringens type A antisera, indicating similar reactivity with native α-toxin.Recombinant α-toxin protein was simultaneously found in culture supernatant, postsonic supertanant and inclusion bodies, most protein was expressed in inclusion bodies, which indicated recombinant α-toxin protein was expressed in the extracellular, periplasm and cytoplasm.Recombinant α-toxin protein in postsonic supertanant could not make mice die, indicating its non-toxicity.Toxin-antitoxin neutralization test showed that antisera of recombinant α-toxin protein were specific to α-toxin.Upon immunization of rabbit with the recombinant α-toxin protein, antisera with high antibody titer neutralizing 100 MLD toxin per 1 mL were prepared.     

兔水疱性口炎的血清学诊断

1液相阻断酶联免疫吸附实验 样品采集为被检兔的血清样品。固相载体用pH值9.6的碳酸盐（CBS）缓冲液将兔抗血清作适当稀释,包被ELISA反应板,4℃过夜。然后用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBST）洗板3次,再用2%卵白蛋白室温封闭1小时。洗板3次后备用。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp4的表达及其抗血清的制备

根据GenBank中已发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）HuN4株全基因组序列,设计合成一对引物,对PRRSV HuN4株非结构蛋白Nsp4（Nonstructural protein 4基因进行RT-PCR扩增,克隆到原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体pET30a-Nsp4,经酶切测序鉴定。将pET30a-Nsp4转化表达菌株BL21（DE3）,诱导可表达分子量约为27kDa重组蛋白。Westernblot显示其具有较好的反应原性,经镍离子亲和层析（Ni-NTA）纯化获得了高纯度的可溶性重组蛋白。将纯化的Nsp4蛋白免疫BALB／c小鼠,抗血清ELISA效价达1：16000,Western blot和IFA表明,所制备的抗血清能够特异性识别PRRSV自身表达的Nsp4蛋白。本研究获得了可溶性的PRRSV Nsp4蛋白,制备了Nsp4特异性多抗血清,为进一步研究Nsp4蛋白的亚细胞定位及功能奠定了基础。     

鲁西黄牛α干扰素基因的原核表达及其抗血清的制备

采用PCR方法从鲁西黄牛基因组DNA中克隆了α干扰素(BoIFN-α)基因,并插入到pET32a+中,构建成重组原核表达质粒pET32a+/BoIFN-α,进行测序和诱导表达.测序结果表明,鲁西黄牛IFN-α基因全长498 个核苷酸,含1个开放阅读框(ORF),编码166 个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的牛α干扰素C亚型氨基酸组成同源性为97.6%.表达产物经SDS-PAGE分析,表达出40 ku的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26.7%.表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化,纯化产物进行复性后免疫昆明系小鼠2次,制备高滴度的牛IFN-α抗血清.结果从鲁西黄牛中克隆了IFN-α基因的一种新亚型,即BoIFN-α C2,实现了高效表达和纯化,并制备了鼠抗牛IFN-α,为重组牛干扰素的开发奠定了基础.     

基于抗原表位策略的苹果茎痘病毒抗血清的制备

苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)是一种严重危害果树生产的潜隐性病毒,但缺乏实用的ASPV抗血清。应用不同生物信息学软件对ASPV外壳蛋白不同区域的抗原指数、蛋白二级结构中α螺旋、β片层、β转角、无规则卷曲结构、亲水性、可塑性(Flexibility)和表面可及性(Surface probability)进行了分析。根据抗原表位主要分布在β转角结构和无规则卷曲区域、亲水性和表面可及性参数较高的特点,综合分析预测ASPV外壳蛋白抗原表位区可能位于N端6-20、100-114、400-414位氨基酸残基附近。通过合成2条多肽(CRGYEEGSRPNQRVLP、CTGGKIGPKPVLSIRK),与载体蛋白偶联后免疫动物,最后得到了2份抗血清(编号为1468和1469)。制备的抗血清可与ASPV外壳蛋白基因原核表达产物产生免疫反应。应用此抗血清检测苹果样品,抗血清1468检测结果与RT-PCR检测结果一致,而抗血清1469仅能检测到部分样品。     

禽流感病毒PB2亚单位抗血清的制备

采用RT-PCR方法分段扩增PB2基因,将目的基因定向克隆至含HisTAG的原核表达载体pET-32a,经序列验证正确后,转化BL21大肠杆菌,诱导表达重组蛋白。靶蛋白经Ni+柱纯化后与弗氏免疫佐剂混合免疫新西兰大耳白兔,获得高效价的抗PB2的抗血清。Western-blot检测结果证实制备的抗血清可与PB2蛋白发生特异性反应。进一步将PB2全长基因准确插入真核表达载体pCAGGS,转染293T细胞表达PB2蛋白,通过IFA检测发现,抗血清与细胞表达的PB2蛋白发生反应,出现特异性荧光,经激光共聚焦检测PB2亚单位只在细胞核中出现荧光,说明PB2亚单位单独表达仅限于细胞核内。上述研究为进一步探索PB2亚单位的生物学特性及其结构与功能研究打下基础。     

稻瘟菌侵染诱导的水稻过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶的抗血清制备

 通过选择性抽提、盐析、阴阳离子交换柱层析等步骤从非亲和性稻瘟菌侵染的120g稻叶中获得了诱导性过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶(POG)的电泳纯蛋白250μg。利用这些纯化蛋白,制备了POG的抗血清。点免疫杂交结果表明,该抗血清效价大于1:5000,其抗原检测灵敏度可达0.05ng,并具有较好的特异性。蛋白印迹结果显示,稻瘟菌侵染可诱导POG在水稻细胞膜上的累积。     

鸡抗REV血清的制备与检定

用网状内皮组织增生症病毒（REV）HA9901株免疫SPF鸡,无菌采血制备鸡抗REV血清。通过ELISA、IFA、AGP、HI等方法对制备的血清进行检测,未检出禽类常见的其他17种（或亚型）病毒的抗体,该血清具有良好的特异性。通过测定,该血清用于间接免疫荧光试验（IFA）的效价为1：2000,用于IFA检测REV的染色效果与REV单抗（11818和11854的混合物）相当。试验结果表明,该批血清1000倍稀释可作为一抗,用于REV的间接免疫荧光检测。