猪圆环病毒Ⅱ型体外诱导3D4/2细胞炎症模型的建立

【目的】通过对猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）体外感染3D4/2细胞浓度、时间与细胞炎症水平进行探讨,建立PCV2体外感染3D4/2细胞炎症反应模型,以期为后期药物调控PCV2诱发3D4/2细胞炎症反应的研究奠定基础。【方法】将3D4/2细胞分为对照组及10⁰、10^-1、10^-2和10^-3 PCV2感染组,每组3个重复。对照组用DMEM培养,各PCV2感染组用不同稀释倍数PCV2液培养,2 h后均更换为含5%胎牛血清（FBS）的DMEM维持液进行培养,培养4、8、12和24 h后分别收集细胞及细胞上清液。采用Griess法检测一氧化氮（NO）水平,DCFH-DA荧光探针法检测活性氧（ROS）水平,酶标法检测还原型谷胱甘肽（GSH）水平,分光光度法检测黄嘌呤氧化酶（XOD）和髓过氧化物酶（MPO）活性,ELISA法测定白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-10、γ干扰素（IFN-γ）、IL-8、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）以及环氧合酶1（COX-1）和COX-2的分泌水平。【结果】10⁰至10^-3 PCV2作用4、8、12和24 h均能够成功感染3D4/2细胞。与对照组相比,10⁰ PCV2在感染3D4/2细胞4、8、12、24 h后ROS水平均极显著升高（P<0.01）,10^-1至10^-3 PCV2感染3D4/2细胞8、12、24 h后ROS水平显著或极显著升高（P<0.05;P<0.01）;10⁰至10^-3 PCV2感染3D4/2细胞8、12、24 h后,细胞内NO浓度及MPO活性显著提高（P<0.05）,细胞上清液中的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-8和MCP-1水平及COX-1活性均显著或极显著升高（P<0.05;P<0.01）,其中10⁰ PCV2感染3D4/2细胞后,各炎症因子水平上升最显著,且随着时间的延长,NO浓度逐渐升高,XOD活性逐渐降低。【结论】PCV2可诱导3D4/2细胞炎症反应,且10⁰ PCV2体外感染3D4/2细胞4~12 h是建立炎症模型的最佳条件。     

规模化猪场免疫效果影响因素分析及改善措施

1圆环病毒病猪圆环病毒作为对猪场危害很大的疾病之一,一旦发作就会导致猪的免疫力下降和生长发育受阻。这个病毒会很快传染给养殖场里面的其它猪,所以一旦有个别猪发病,要及时采取措施避免其快速传播。目前圆环病毒在发病的时候,表现形式比较多,有皮炎肾病综合征、仔猪抖抖病和断奶仔猪多系统衰竭综合征这三种,主要发病的群体都是仔猪。     

非洲猪瘟病原学检测技术研究进展

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和野猪而引起的一种急性烈性、高度接触性传染病,到目前为止仍未研制出有效疫苗,因此病原的早发现对ASF防控尤为重要。ASFV的病原学检测主要包括活病毒检测、核酸检测和抗原检测。活病毒检测中,病毒分离和红细胞吸附试验均耗时较长,且对实验室要求较高,通常只有被参考实验室采用。病毒核酸检测中,普通PCR和实时荧光定量PCR(qPCR)是OIE推荐的首选诊断方法,其特异性和灵敏度均较高,但操作复杂、成本高;等温扩增技术操作简单、成本低,不需要特殊仪器,检测时间短、携带方便、灵敏度高,适用于屠宰场、养殖场现场检测,但因特异性不高,需要不断更新和改进;微流控芯片法具有样品消耗少、检测速度快、操作简便、便于携带等优点,但检测成本高,需要特定的设备,尚未被广泛使用。抗原检测技术中,荧光抗体检测(FAT)对实验室要求较高,不适合现场检测;夹心ELISA和胶体金免疫试纸条检测快速,操作简单,检测成本低,但敏感性和特异性还需改进。ASF病原学检测技术虽很成熟,但各有不足,所以应根据实际情况结合使用。     

羊布鲁氏菌病直接经济损失与防控成本效益分析方法构建及实证研究

为了解我国布鲁氏菌病（以下简称“布病”）一类地区羊布病造成的直接经济损失及防控投入合理性,构建了羊布病直接经济损失指标体系和防控成本效益评估方法,并对我国羊主产区4省份17市县的防疫部门和319个养羊场户进行实地走访与问卷调查。共回收防疫部门问卷21份,场户有效问卷301份,涉及124个布病羊场和177个无布病羊场。运用Excel、SPSS等软件,对问卷数据进行统计分析。结果显示：2020年单只布病羊直接经济损失平均为4 557元（不含奶羊）,各省份羊布病损失为 1.8亿~20.4 亿元,其中养羊场户损失占比较高,占总损失的 73.0%~81.0%;各省份政府的布病防控效益成本比为5:1~38:1。结果表明,羊布病导致的经济损失严重,对其防控可取得显著经济效益。建议养殖户及政府进一步加大布病防控投入,而且政府应提高预防性投入比重。本研究为优化布病防控政策提供了技术支撑。     

云南省边境地区牛阿卡斑病毒血清学调查

为掌握云南省边境地区牛群中的阿卡斑病毒（Akabane virus,AKAV）流行情况和分布特征,采用竞争ELISA检测方法,对2019—2020年采自云南省边境地区10个县市的牛群血清样品进行AKAV抗体检测与分析。结果显示：在采集的4 437份牛血清样品中,检出抗体阳性样品1 367份,平均抗体阳性率为30.81%;2019年抗体阳性率为27.88%,2020年为32.14%,差异不显著（P＞0.05）;入境牛抗体阳性率显著高于本地牛（P＜0.05）;养殖场抗体阳性率略高于散养户和交易市场,但三者间差异不显著（P＞0.05）;舍饲牛群的抗体阳性率显著高于半放牧半舍饲和系牧饲养（P＜0.05）,黄牛的抗体阳性率明显高于水牛（P＜0.05）。结果表明,云南省边境地区存在一定程度的AKAV感染且有加重趋势,入境牛感染风险较高,需持续开展血清学调查和监测,加强境外牛的检疫和移动控制,降低AKAV向内地扩散的风险。本研究摸清了云南省边境地区牛群中的AKAV流行本底,为今后该病毒流行控制策略的研究与制定提供了参考。     

重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗对麻鸭和番鸭免疫效果观察

为评价重组禽流感病毒三价灭活疫苗（H5N1 Re-11+Re-12株、H7N9 Re-2株）对麻鸭和番鸭的免疫特性,优化商品麻鸭和番鸭养殖场禽流感免疫程序,开展了麻鸭、番鸭现场免疫试验。以推荐的免疫程序和剂量分组免疫21日龄麻鸭和番鸭,免疫后定期采血测定抗体效价。结果显示：一免组麻鸭在35、49、63日龄产生的H5N1（Re-11、Re-12株）和H7N9 Re-2株HI抗体效价均低于5.70log2,抗体合格率为73%~89%;二免组麻鸭针对三种抗原的抗体滴度均大于6.00log2,抗体合格率均大于86%。一免组番鸭在35日龄的H5N1（Re-11、Re-12株）和H7N9 Re-2株HI抗体效价和合格率分别为5.54log2和90%,5.61log2和90%,5.63log2和90%;49日龄分别上升至6.01log2和100%,6.07log2和100%,6.15log2和100%;63日龄分别为5.66log2和100%,5.79log2和100%,5.81log2和100%;二免组番鸭在35~63日龄时,各毒株抗体滴度都较高,抗体效价均高于6.40log2,抗体合格率均为100%。对照组麻鸭与番鸭在35、49、63日龄抗体合格率均较低。结果表明,二次免疫可增强免疫保护效果。本研究为广大养殖户制定水禽高致病性禽流感免疫程序提供了数据支撑。     

羊痘病毒属病毒通用Cycleave PCR检测方法的建立

为快速特异检测羊痘病毒属病毒（CaPVs）,比较了牛结节性皮肤病病毒（LSDV）、山羊痘病毒（GTPV）和绵羊痘病毒（SSPV）的全基因组序列,选择保守区域设计特异性引物和探针,建立了一种CaPVs通用的Cycleave PCR检测方法。特异性结果显示,该方法在40 min内即可检出CaPVs,与口蹄疫病毒、羊口疮病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒均无交叉反应;灵敏性结果显示,最低检出限为4.98 copies/μL;重复性结果显示,批内和批间重复变异系数均小于2%。对131份临床样本进行检测发现,该方法与世界动物卫生组织（WOAH）推荐的常规PCR方法相比,敏感性为100%,特异性为91.55%,总符合率为95.42%。以上结果表明,本研究建立的Cycleave PCR检测方法特异、敏感、重复性好,且操作简便,适用于CaPVs的高通量、快速检测。     

猪流行性腹泻病毒云南省流行毒株S1基因序列分析

为深入了解云南省猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）的流行现状及现有疫苗株的保护效果,从2017—2022年云南省PEDV感染临床阳性样品中扩增出9份样品的PEDV S1基因,利用生物信息学方法,对9份样品S1基因进行了遗传进化树构建、同源性分析和氨基酸突变位点分析等。结果显示：2份样品位于G1基因群,其余7份位于G2基因群的G2b基因亚群。7份G2b基因亚群样品的核苷酸和推导氨基酸同源性较高,与G2基因群的AJ1102和L/W/L疫苗株处于不同基因亚群且同源性较低,并在第13、139、289和363位发生了不一致的突变位点;与现有疫苗株相比,在抗原中和位点COE区域以及其他区域,有明显的抗原性变化。结果表明：云南省存在G1基因群和G2b基因亚群PEDV同时流行,但以G2b基因亚群为主;流行株和疫苗株间存在较远的遗传和亲缘关系,以及氨基酸突变和抗原性差异,这很可能是导致目前PED控制不理想的原因,因此需要研发安全有效的疫苗。     

2020年福建省龙岩市水禽坦布苏病毒检测及其NS5基因变异分析

为了解龙岩市水禽坦布苏病毒（ATV）感染情况及其NS5基因遗传变异情况,对采自福建省龙岩市7个县（市、区）农贸市场、规模化禽场和散养户的鸭泄殖腔棉拭子2 885份、鹅泄殖腔棉拭子样品320份进行ATV RT-PCR检测,并对部分阳性样品进行病毒分离鉴定及NS5基因序列测定与遗传进化分析。结果显示：ATV总阳性率为17.19%（551/3 205）,其中鸭、鹅样品阳性率分别为16.81%（485/2 885）、20.63%（66/320）,差异显著（P＜0.01）;按不同场所统计,散养户水禽样品ATV阳性率最高（20.68%,304/1 470）,农贸市场次之（15.19%,224/1 475）,规模化养殖场最低（8.85%,23/260）,相互间差异显著（P＜0.01）;按被检水禽日龄统计,90~＜180日龄水禽样品阳性率最高（21.29%,397/1 865）,180~＜380日龄次之（17.62%,74/420）,30日龄内最低（4.44%,4/90）;春季水禽样品阳性率（22.74%,362/1 592）明显高于秋节（11.72%,189/1 613）。将部分ATV阳性样品经鸭胚分离培养,共分离出13株鸭源、鹅源ATV毒株。对这13株分离株NS5基因片段进行核苷酸序列分析发现,其同源性高达98.6%~100%,与国内ATV代表株核苷酸序列同源性介于96.5%~99.7%,且处于同一进化树分支,而与澳大利亚等国外分离株亲缘关系较远。结果表明,目前福建省龙岩市鸭、鹅等水禽中存在不同程度的ATV感染,流行毒株仍为国内当前流行毒株,未出现明显变异。本研究了解了该地区ATV的流行特点及基因遗传进化情况,为制定ATV感染防控措施提供了依据。     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为快速、准确、灵敏检测猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）,以PEDV N基因为靶标设计引物,建立了一种PEDV SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。该方法最低可以检测到10个拷贝的病毒核酸,与猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪轮状病毒等胃肠道病毒均无交叉反应,批内、批间重复试验的变异系数均在2%以内,表明该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。运用该方法对2018—2019年采集自山东省不同地区猪场的161份临床样品进行检测,检测结果与RT-PCR方法完全一致。以上结果说明,本试验所建立的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测方法为PEDV的快速检测提供了良好工具和技术支持。