蓝塘猪和大白猪消减cDNA文库与差异基因分析

 【目的】寻找肉质性状候选优势表达基因,研究猪肉质优良性状的遗传基础和分子机制。【方法】利用抑制性消减杂交技术构建蓝塘猪和大白猪肌肉组织差异表达的消减cDNA文库,利用实时荧光定量PCR法研究基因的差异表达。【结果】获得61个有效克隆。对整个文库进行测序分析,获得47条有效序列。用BLAST在线软件与GenBank 和GenBank EST等数据库进行同源序列比较,发现其中有2条未知序列。对文库中所包含的MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3、HUMMLC2B、GNTN和Oaz等基因进行了实时荧光定量PCR检测,结果显示MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3和HUMMLC2B这5个基因在蓝塘猪肌肉组织的表达量显著高于大白猪（P＜0.05）;GNTN和Oaz基因在大白猪肌肉组织中的表达量显著高于蓝塘猪（P＜0.05）。【结论】很多EST与肉质有关的重要基因具有很高的同源性,这些基因在蓝塘猪和大白猪中表达差异显著（P＜0.05）。     

茉莉酸等3种因素刺激番茄对LeWRKY1表达的影响分析(英文)

[目的]为了研究LeWRKY1参与植物抗逆反应的分子机理。[方法]采用实时荧光定量PCR技术研究了LeWRKY1在番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)侵染、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、水杨酸(salicylic acid,SA)刺激时的表达情况。[结果]外源植物激素JA可诱导LeWRKY1的表达,而SA对其无明显诱导作用;番茄灰霉菌侵染可诱导LeWRKY1表达。[结论]LeWRKY1可能通过JA依赖而SA非依赖的信号途径参与番茄对番茄灰霉菌防御反应的应答。     

miRNA-181b在牛腺垂体中的表达规律及其调控作用研究(英文)

[目的]探索miRNA-181b在成熟(18月龄)和未成熟(1月龄)牛腺垂体中差异表达量及其调控功能。[方法]通过构建成熟(18月龄)和未成熟(1月龄)的延边黄牛腺垂体组织miRNAcDNA文库,对文库中的miRNA进行Solexa高通量深度测序,并对公牛腺垂体中的miRNA进行鉴别。从测序结果中挑选出具有差异表达的miRNA-181b,经实时荧光定量PCR验证其在不同发育期延边黄牛腺垂体中的表达规律,并通过TargetScanS预测miRNA-181b的靶基因。[结果]miRNA-181b在不同发育期牛腺垂体表达量存在显著差异,1月龄公牛腺垂体中miRNA-181b表达量是18月龄的4.05倍。miRNA181b与FSHβ基因3 非编码区838 ~844碱基可能是特异结合,其结合碱基为UGAAUGUA。[结论]该研究为FSHβ的转录后调控研究提供了理论依据。     

脂肪酸合成酶基因的研究进展

在脂肪酸的合成过程中,脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)是一种多功能的复合酶,是合成脂肪酸的关键酶,因此,动物体内脂肪酸合成酶蛋白的多寡、活性的高低对动物脂肪酸的合成及体脂的沉积具有重要的意义。近年来,国内外大量的研究报道了脂肪酸合成酶对脂肪合成、代谢的调控。作者将从脂肪酸合成酶基因结构特征,其与能量代谢及体脂沉积的关系,以及日粮养分与激素对脂肪酸合成酶基因的表达调控研究进行综述。     

流产型布鲁氏菌Omp22基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

通过PCR获得流产型布鲁氏菌Omp22基因的编码区,将其克隆到pSOS载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pSOS-Omp22。测序正确后,将重组质粒导入cdc25H检测其表达产物对酵母细胞有无毒性和自激活作用,且在酵母细胞中定位是否正确。结果表明,获得了正确的流产型布鲁氏菌Omp22基因编码区,并成功克隆到pSOS诱饵载体中,且转化有诱饵载体的cdc25H在SD/Glucose(-L)营养缺陷平板上生长良好,说明表达产物对酵母细胞无毒性,对报告基因也无自激活作用且其定位正确。表明pSOS-Omp22可应用在酵母双杂交系统中,用于寻找巨噬细胞cDNA文库中与Omp22相互作用的蛋白质。     

绵羊妊娠期生殖组织Flt-1基因的克隆及其组织表达量的检测

试验从雌性绵羊妊娠期不同阶段的输卵管、子宫内膜、卵泡组织中提取总RNA,根据已发表的绵羊Flt-1基因的cDNA序列设计引物,以β-Actin基因为内参,采用RT-PCR扩增绵羊Flt-1基因,将扩增产物克隆于载体后进行序列分析,并应用Kodak Science 1 D、Bandscan图像分析软件,推断出不同组织中Flt-1基因的表达量。结果表明,从雌性绵羊妊娠期不同阶段生殖道各组织上皮均获得82 bp的Flt-1基因的扩增片段,且Flt-1基因在雌性绵羊生殖道各组织内的表达量不同。说明Flt-1基因对绵羊的妊娠维持起着重要的作用。     

猪乳铁蛋白N叶(PLF-N)在毕赤酵母中的表达及抑菌活性鉴定

根据猪乳铁蛋白N叶(PLF-N)的蛋白序列和毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过全基因合成法合成改造后的PLF-N基因片段,将其克隆到pGAPZα-A质粒中构建分泌型重组酵母表达载体 pGAPZα-A- PLF。pGAPZα-A- PLF 通过限制性内切酶Avr Ⅱ酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168内。PCR检测结果发现,PLF-N基因与毕赤酵母染色体稳定结合,Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子。在GAP启动子调控下,PLF-N重组蛋白获得分泌表达,其分子质量约为38 ku,上清表达量约为364 μg/mL。琼脂糖孔穴扩散法检测结果显示,该表达产物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌活性,且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)分别为12.5、25.0 μg/mL。     

金黄色葡萄球菌FnbpA、ClfA、Ebps抗原表位的串联表达及多克隆抗体的制备

为获得金黄色葡萄球菌特异性抗原蛋白并以此制备多克隆抗体,应用DNAStar软件筛选金黄色葡萄球菌FnbpA、ClfA、Ebps的抗原表位,以柔性氨基酸序列连接后进行全基因合成,将目的基因克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,转化至大肠杆菌感受态细胞,诱导表达,采用Sepharose 4B柱亲和层析纯化表达蛋白,制备抗原后对家兔进行皮下多点注射,于第42天采集外周血,获得血清。结果表明,本试验成功构建了金黄色葡萄球菌抗原基因表达载体,并获得了高免血清,经ELISA的方法检测血清效价可达到1∶10000以上,成功制备多克隆抗体,为以后采用免疫学方法快速检测金黄色葡萄球菌奠定了基础。     

猪β干扰素的基因改造及真核表达

本试验选择高表达密码子重新设计合成猪β干扰素成熟肽核苷酸,通过设计特异的引物,在毕赤酵母表达系统中表达PoIFN-β,获得分泌表达的高活性重组PoIFN-β,并采用非洲绿猴肾细胞(Vero)-水泡性口炎病毒(VSV)系统以细胞病变抑制法测定重组猪β干扰素的效价,为指导重组PoIFN-β的临床使用和研究其生物学功能提供基础。     

水貂肠炎病毒VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV) VP2 基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEV VP2 基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10 Bac感受态细胞,获得重组Bacmid 质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行 Western blotting鉴定。结果成功克隆MEV VP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在 Bac-To-Bac 杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。