流行性乙型脑炎prM蛋白剪切位点突变的prM-E蛋白表达细胞系的建立

为建立稳定共表达乙型脑炎病-毒(JEV)完整M前体蛋白(prM)和E蛋白的BHK-21细胞系,本研究在prM蛋白furin蛋白酶剪切位点编码基因中引入突变,将突变后的prM基因克隆于质粒中构建重组表达质粒pCAG-JEV-prM(R89A)E.将重组质粒转染BHK-21细胞,转染48 h后细胞用含G418的选择性培养基选择培养,进一步经细胞克隆纯化制备表达剪切位点突变的JEV prM-E蛋白的稳定细胞系.经IFA和western blot鉴定表明,该细胞系能表达JEV prM与E蛋白,所表达的prM蛋白未发生剪切;细胞经多次传代后仍能够稳定地共表达prM与E蛋白.该细胞系的建立为研究prM蛋白剪切对JEV粒子形成的影响以及亚单位疫苗的制备奠定了基础.     

人血小板生成素基因的克隆及CHO稳定细胞系的建立

 以人肝cDNA为模板克隆了人血小板生成素（Human Thrombopoietin,hTPO）基因,利用基因重组技术构建了带有新霉素抗性基因（neo）筛选标记的pcDNA3.1(+)-hTPO真核表达载体,将重组质粒瞬时转染293T细胞,用鼠抗人TPO 单抗Western blot 检测 TPO蛋白的瞬时表达;再将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO),应用400 μg/mL的G418筛选克隆,经PCR及Western blot验证,获得了3株hTPO蛋白表达水平不同的CHO细胞系,为获得大量蛋白并进行活性功能试验及临床应用奠定基础。     

甜菜基因型的筛选及胚性细胞系建立的研究

通过以甜菜未成熟胚为外植体诱导愈伤组织，再将产生的愈伤组织转移至分化培养基（ＭＳＢ培养基附加１．０ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ、３％蔗糖、８％琼脂）进行分化力测试实脸，筛选出两个再生能力强的基因型─８９３０、ＧＤ＿２．通过挑选淡黄色或灰白色、呈颗粒状的愈伤组织继代培养，经调节培养基的ＩＡＡ和ＮＡＡ的浓度，得到再生能力强的胚性愈伤组织，建立了胚性细胞无性系。     

草鱼肾组织细胞系CIK的建立及其生物学特性

作者于1982年1月开始进行草鱼肾组织单层细胞培养，至今已连续培养32个月，传至120多代，建立了细胞系，定名为草鱼肾组织细胞系(CIK)。本文介绍了原代和传代培养、细胞形态、细胞生长速度和分裂指数、细胞的保存和对温度的适应性、细胞染色体分析以及细胞系对病毒敏感性的试验和研究结果。CIK生长迅速、适应性强、以20℃-38℃生长较好，28℃左右生长稳定，pH为6．5时仍能保持致密单层，染色体数为非整倍体，众数为55。对草鱼出血病左右病毒FRV具敏感性。     

不同启动子在水稻悬浮细胞中诱导外源基因的表达

为进一步提高外源基因在水稻悬浮细胞中的表达水平,以花椰菜花叶病毒(Ca MV)35S启动子为对照,克隆了玉米泛素蛋白启动子(Ubi)、水稻肌动蛋白启动子(Actin)以及水稻Oscc1启动子,以GFP为报告基因,通过启动子串联的方式,构建了10个植物表达载体:p CAMBIA 1304 35S-GFP、Ubi-GFP、Actin-GFP、Oscc1-GFP、35S/Ubi-GFP、35S/Actin-GFP、35S/Oscc1-GFP、Ubi/Actin-GFP、Ubi/Oscc1-GFP、Actin/Oscc1-GFP,采用根瘤农杆菌介导的方法,将表达载体导入日本晴胚性愈伤,经悬浮培养分别获得转基因的悬浮细胞系,利用荧光显微镜、酶标仪检测GFP荧光强度,用Western blot检测GFP蛋白质的表达水平。结果发现串联启动子明显强于单个启动子驱动的GFP蛋白质表达水平。在10个表达载体中,35S/Ubi、Ubi/Actin和Ubi/Oscc1是3种优化的启动子组合,其中Ubi/Oscc1串联启动子驱动GFP的表达水平最高,约为对照35S启动子的3倍。     

草鱼尾鳍组织二倍体细胞系GCCF-2的建立及其部分生物学特性分析

本文从草鱼尾鳍组织建立了一个二倍体细胞系GCCF-2。该细胞系用TC-199培养液加15％小牛血清培养。细胞生长旺盛,最高分裂指数达30.04‰。现已在体外培养近92个月。细胞在28℃生长良好。染色体检查表明,GCCF-2为二倍体细胞系。初步估计其细胞周期为21—33小时。GCCF-2对草鱼呼肠弧病毒(GCRV)敏感,并在细胞中发现病毒颗粒。     

稳定表达禽β防御素2的DF-1细胞系的建立及其抗大肠杆菌活性

旨在建立一株稳定表达禽β防御素2(AvBD2)的细胞系,并检测细胞系分泌产物对耐药菌株的抑制效果。首先,根据同源重组设计方法设计一组含有同源臂的AvBD2基因扩增引物及载体反向扩增引物,将片段连接至pLOV-eGFP真核表达载体,构建真核重组质粒pLOV-eGFP-AvBD2,利用三质粒表达系统将重组质粒与慢病毒包装质粒pSPAX2、外膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,收集细胞分泌上清液感染DF-1细胞,嘌呤霉素最适浓度筛选获得阳性克隆细胞系,通过RT-PCR技术和Western Blot方法对该细胞系构建结果加以验证;将细胞系分泌产物与耐药大肠杆菌菌株混合培养后,检测该蛋白抗菌效果,并通过扫描电镜观察菌体的损伤现象。结果表明,已成功构建一种稳定表达AvBD2蛋白的DF-1细胞系,其最适筛选浓度为含有1μg/mL的嘌呤霉素的细胞培养液。该细胞系传递20代后,在mRNA转录水平及蛋白表达水平均验证正确,将细胞系的分泌产物培养耐药大肠杆菌,细菌存活率曲线显示随着培养时间的增加,细胞系上清可明显抑制耐药菌株的增殖,在培养第5小时使供试菌的存活率低于50%。扫描电镜显示供试菌体表面皱缩,存在明显损伤,而对照组菌体光滑饱满。建立了稳定表达AvBD2蛋白的DF-1细胞系,为抗生素替代品的生产制备提供探索方向,同时也为后续评价和研究AvBD2的抗菌作用奠定基础。     

测序方法影响小RNA测序结果

第二代测序技术是识别和定量细胞中小RNA组分的一种重要方法。随着测序技术的不断进步和成熟,以及测序成本的不断降低,这种技术在当代科学研究中发挥了越来越大的作用。但是,还很少有人关注不同的测序平台和文库构建方法     

大麻素Ⅰ型受体基因(CNR1)特异性siRNA表达载体的构建及稳定干扰阳性L6细胞克隆的筛选

大麻素Ⅰ型受体(CNR1)是介导内源性大麻素发挥作用的关键分子,在食欲和能量代谢调控中发挥着重要作用.为了更深入研究CNR1的基因功能,本实验旨在构建和筛选有效沉默CNR1基因的干扰表达载体,并筛选出稳定转染干扰质粒的阳性细胞系.设计合成3对CNR1基因的特异性发夹小干扰RNA(siRNA)干扰引物,将其连接入干扰载体pYr-1.1,构建可沉默CNR1基因的siRNA表达载体CNR1-1、CNR1-2和CNR1-3.并采用LipofectamineTM(Lip)2000介导质粒转染L6细胞,绿色荧光蛋白的表达和流式细胞仪监测转染效率,通过实时荧光定量分析siRNA表达载体的干扰效果.并进一步用G418进行了稳定转染细胞筛选.结果显示,CNR1基因的siRNA表达载体构建正确,瞬时转染L6细胞的转染效率分别为10.45％(P＜0.01)、8.57％(P＜0.01)和8.71％(P＜0.01);干扰效率为39％(P＜0.05)、64％(P＜0.01)及68％(P＜0.01).稳定筛选的最佳G418浓度为800 μg/mL,稳定筛选后干扰效率分别为43％(P＜0.05)、78％(P＜0.01)及91％(P＜0.01).干扰效率较高的CNR1-3表达载体和稳定转染CNR1-3的细胞系为构建筛选成功的siRNA表达载体和阳性细胞系.本研究提供了一种有效沉默CNR1基因表达的方法,同时稳定沉默的阳性L6细胞系成功筛选为进一步研究大麻素Ⅰ型受体的基因功能提供了基础资料.     

细胞外信号调节激酶5RNA干扰稳定细胞系的建立

ERK5通路是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路家族成员之一,是一种非典型的MAPK通路,也叫做大MAPK通路(Big MAPK/BMK1),可以被各种刺激因素激活,与多种细胞反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)及机体多种生理病理过程(如脑发育、癌症及糖尿病等)密切相关.采用RNA干扰的方法,用构建的ERK5干扰质粒干扰ERK5表达,通过RT-PCR和Western-blotting的方法分别在RNA和蛋白水平上来检测ERK5的表达,鉴定干扰效率;通过G418对转染了干扰质粒的鼠恶性黑色素瘤细胞(B16F10细胞)进行稳定筛选,得到ERK5 RNA干扰的B16F10稳定细胞系,为后期的动物实验做准备.

Abstract：

ERK5 (extracellular-regulated kinase 5) signal pathway is a member of the MAPK family. It is an atypical MAPK signal pathway and is also named Big MAPK/BMK1. ERK5 signal pathway can be activated by various stimulating factors, and is closely associated with many kinds of cell responses, such as proliferation, differentiation, transformation and apoptosis. It is also related to the processes of physiological and pathological reactions including the development of brain, cancer and diabetes. In this study,RNAi (RNA interference) was applied to decrease the expression of ERK5. The expression of ERK5 was detected by RT-PCR and Western-blotting. B16F10 cells transformed by constructed ERK5 shRNA plasmids were stably screened using G418, and an ERK5 RNAi B16F10 stable cell line was obtained, whichwas ready for further animal experiments.