甜瓜黄斑病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法

为建立检测甜瓜黄斑病毒(melon yellow spot virus, MYSV)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qPCR)方法。基于MYSV核衣壳蛋白基因保守序列设计qPCR特异性引物对,针对引物退火温度、引物浓度、特异性和敏感性进行系列优化。结果显示,优化后的qPCR方法最适退火温度为61.3℃,最适引物浓度为0.65μmol·L^-1,特异性强,灵敏度高,比PCR高100倍。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的qPCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.999 7。实验样品验证表明建立的qPCR方法可用于MYSV的定量检测。     

薄壳山核桃疮痂病菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

疮痂病是薄壳山核桃上最具毁灭性的病害,带菌植物材料是传播疮痂病的重要来源。准确、灵敏、快速的检测方法可为该病害流行规律调查和防控提供有力的依据。本文通过比较薄壳山核桃疮痂病菌Venturia effusa及其近似种之间的ITS序列差异,设计了特异性引物和TaqMan探针,建立了薄壳山核桃疮痂病菌的荧光定量PCR检测方法。特异性检测结果表明,该方法可以检测不同地区的薄壳山核桃疮痂病菌菌株,而对其近似种以及薄壳山核桃上的其他真菌均没有信号。本研究建立的检测方法对薄壳山核桃疮痂病菌DNA的最低检测限可达0.5 pg/μL。该方法用于田间样品检测时,检测时间仅需1 h,远快于常规的分离培养法。本研究建立的基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测方法为薄壳山核桃疮痂病菌的快速检测和监测提供了有力工具。     

进境玉米中玉米内州萎蔫病菌PCR检测方法评估

为了准确检测玉米样品中玉米内州萎蔫病菌（Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis,Cmn）,减少测试过程中的假阳性和假阴性结果,利用15对Cmn特异性引物/探针分别测试了Cmn及其他菌株63株,并测试了食用、种用和饲用进境玉米样品300个。测试结果表明,常规PCR和实时荧光PCR方法阳性检出率最高的引物/探针分别是引物PSA-7/PSA-R和探针Cmn-MGB;巢式PCR不适用于样品中Cmn的检测;检测过程中引物Cmn-4F/Cmn-4R和探针rpsJ27P出现假阴性,引物CmnFP/CmnRP出现假阳性。根据测试结果,引物PSA-7/PSA-R和探针Cmn11-P可用于口岸进境玉米样品Cmn检测。     

荧光定量PCR法检测点带石斑鱼神经坏死病毒研究

根据己公布的神经坏死病毒全基因序列,应用引物设计软件依据Gene Bank所收录的各种石斑鱼神经坏死病毒RNA2基因组全序列选择保守区域,根据Taqman探针引物设计原则,设计Taq Man探针及其引物。采用Taq Man探针技术,并且将假病毒技术构建的含有神经坏死病毒RNA2基因组的MS2噬菌体假病毒作为阳性质控品,建立Taq Man探针检测点带石斑鱼神经坏死病毒的荧光定量PCR方法,拟合标准曲线,能够在病毒检测中进行绝对定量,能检测到10个病毒拷贝模板数,在临床检测中得到很好运用。本研究建立实时荧光定量RT-PCR,有助于日常检验工作,为鱼类神经坏死病毒的筛选和监测提供基础,有助于控制神经坏死病的疫情传播。     

某牛场粪源大肠杆菌0157∶H7的分离鉴定

为了解重庆市某牛场牛群大肠杆菌O157∶H7的感染情况,我们以牛场犊牛为研究对象,采集其新鲜粪便,经LB培养基增菌培养、免疫磁珠富集后,在山梨醇麦康凯琼脂上划线培养,最后PCR扩增eaeA基因目的片段,以此分离鉴定粪源大肠杆菌O157∶H7。结果显示：在所采集的39份犊牛粪便样品中,分离得到一株符合大肠杆菌O157∶H7生长特点且含有eaeA基因的菌株。     

亚急性铜、镉暴露对鲤肝脏Hsp60表达的影响

试验通过实时定量PCR和Western blot技术,检测重金属铜、镉单一及联合急性暴露后鲤肝脏中Hsp60基因和蛋白水平。鲤随机分为7组,两个Cu2+处理组(0.05 mg/l和0.1 mg/l),两个镉处理组(0.63 mg/l和1.26 mg/l),两个混合处理组(0.045 mg/l和0.09 mg/l)和对照组。结果表明铜、镉单一及联合急性暴露对鲤有毒性作用,经过96 h的暴露,除混合低浓度组之外,其余各组肝脏中Hsp60基因表达水平显著提高(P0.05)。受重金属暴露的影响,初期鲤肝脏中Hsp60蛋白水平下降,随着时间推移,蛋白水平逐渐上升,混合低浓度组显著高于对照组水平(P0.05)。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性/经典毒株多重RT-PCR方法的建立及应用

为了建立鉴别猪瘟病毒(Classical swine virus,CSFV)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)及经典猪繁殖与呼吸综合征病毒(C-PRRSV)的快速检测方法,根据GenBank中公布的已知序列,设计合成了针对CSFV、HP-PRRSV和C-PRRSV特异性引物。经过引物筛选及对退火温度、引物比例等扩增条件的优化,建立了用2对引物同时检测CSFV、HP-PRRSV和C-PRRSV的多重RT-PCR方法。该方法可同时扩增出287bp的CSFV、374bp的HP-PRRSV和464bp的C-PRRSV目的核苷酸片段,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)等无交叉反应,最低可以检测到11.3pg的CSFV、4.7pg的HP-PRRSV和2.8pg的C-PRRSV总RNA。分别用多重和单项RT-PCR检测了从河北省采集的31份血清或组织样品,其中CSFV、HP-PRRSV、C-PRRSV以及CSFV与HP-PRRSV混合感染的检出率分别为19.4%、22.6%、0%与9.7%,多重与单项RT-PCR的符合率为100%。本试验建立的多重RT-PCR方法可同时鉴别CSFV、HP-PRRSV与C-PRRSV,适于猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测与流行病学调查。     

谈氯化钙注射液在兽医临床上的应用

<正>众所周知,氯化钙注射液的主要成分就是氯化钙,因为氯化钙具有促进骨骼和牙齿钙化形成、维持神经肌肉的正常兴奋性、促进血凝和消炎、抗过敏等多重功效[1],所以氯化钙注射液已成为兽医临床上治疗各种疾病的常用药。但是,目前仍有许多兽医对本品的应用存在诸多误区,致使氯化钙的功效得不到     

PCR假阳性的原因分析及控制措施

近二十年来,PCR作为一种重要的分子生物学技术,广泛应用于动物疫病的病原学、诊断方法、基因工程疫苗研究、检验检疫、疫病诊断、疫情监测及流行病学调查等动物疫病防控实际工作。如何控制好PCR检测的质量,减少假阳性,一直是研究者普遍关注的问题。本文分析了PCR假阳性形成的原因,提出预防及控制措施,为促进实验室PCR实践工作提供参考。     

羊传染性脓疱病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank已经发表的CEV参考毒株(登录号:AF097215)F1L基因序列,利用Primer Express 3.0软件设计合成1对特异性引物,以pMD19-T-63bp重组阳性质粒作为标准品,建立了羊传染性脓疱病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。经过反应条件的优化,建立的羊传染性脓疱病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的线性关系良好,标准曲线的相关系数R2=0.99,扩增效率E=1.18。该方法敏感性高且特异性强,最低检出下限为65.47拷贝/μL,与羊痘和口蹄疫病毒均不发生交叉反应,重复性好,组内和组间变异系数分别为0.17%~0.59%和0.74%~1.25%。运用该方法对2例羊传染性脓疱病例进行检测,结果均为阳性。因此,可将该方法应用于临床诊断,具有准确、高效、快捷、灵敏的特点。