嗜冷黄杆菌CRISPR/Cas系统生物信息学分析

为了开发基于嗜冷黄杆菌CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术,本研究对嗜冷黄杆菌的CRISPR/Cas系统结构及其作用机制进行生物信息学分析。从GenBank数据库中获得8株嗜冷黄杆菌的全基因组序列,利用CRISPRCasFinder软件查找成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）结构和CRISPR相关（Cas）蛋白在嗜冷黄杆菌基因组上的数量和分布;利用CRISPRFinder软件分析CRISPR结构的重复序列和间隔序列,并使用Mega X软件对cas基因核苷酸序列做相似性对比;通过与重复序列配对,获得反式激活crRNA （trans-activating CRISPR RNA,tracrRNA）与重复序列配对序列,使用ARNold软件预测tracrRNA基因的终止子;使用BPROM软件预测tracrRNA基因和crRNA前体（pre-CRISPR RNA,pre-crRNA）的启动子;使用Clustal X软件对所有的间隔序列做相似性对比,并使用CRISPRTarget软件对独特的间隔序列配对从而获得原间隔序列（protospacers）及原间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif,PAM）序列;使用WebLogo软件使PAM序列可视化。结果显示,8株嗜冷黄杆菌均含有1个完整的CRISPR/Cas9系统,由1个CRISPR结构和3个Cas蛋白组成。CRISPR结构由短而重复的序列即重复序列和短而可变的序列即间隔序列相间排列组成;重复序列大小为46 bp,核苷酸序列高度保守;间隔序列大小在29~31 bp之间,数量在20~41个之间。Cas蛋白含有Cas9、Cas1和Cas2,并且cas基因核苷酸序列高度保守。8株嗜冷黄杆菌的tracrRNA基因均位于cas9基因上游并且核苷酸序列相似性为100%。tracrRNA上有一段大小为24 bp的核苷酸序列,其中23个核苷酸与重复序列完全配对。每个重复序列均含有一个较短的启动子,可单独启动pre-crRNA的转录。不同菌株的间隔序列比对结果表明,新获得的间隔序列可以插入到嗜冷黄杆菌CRISPR结构的5'端或内部。在65个独特的间隔序列中,13个间隔序列能够配对上原间隔序列,这些原间隔序列均来源于噬菌体或质粒。原间隔序列上游侧翼序列分析结果表明,嗜冷黄杆菌Cas9识别的PAM序列是5‘-GANTTTT-3’。以上结果表明嗜冷黄杆菌的CRISPR/Cas9系统理论上可以开发适用于嗜冷黄杆菌的基因组编辑技术。     

不同硒源对虹鳟生长性能及抗氧化能力的影响

在以鱼粉为主要蛋白源的基础饲料中分别添加亚硒酸钠和硒酵母，使饲料中硒的含量达到1．5％、2．0％、2．5％、3．0％。基础饲料设为对照组，不添加外源硒，对照组的硒含量为1．0％。在水温10℃～15℃、溶解氧5．6mg／L的条件下，对初始体重150g的虹鳟进行为期50d的生长对比试验。实验结束后取鱼的肝脏及血清，分别测定其超氧化物岐化酶（SoD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—Px）活力及总抗氧化能力（T—AOC）、丙二醛（MDA）的值。结果表明：虹鳟鱼的增重率、饲料利用率各组之间差异不显著。各组之间的SOD、GSH—Px、T—AOC、MDA没有显著差异。因此在以鱼粉为主要蛋白源的虹鳟鱼饲料中添加外源硒，对虹鳟的生长及抗氧化能力没有显著影响。     

四种复方中药和黄芪多糖对鲫鱼生长、组织中NO含量与NOS活性的影响

将四种复方中药(分别编号为AB、AH、CD、IV)和黄芪多糖(APS)作为添加剂添加入基础料饲料中,连续饲喂1龄鲫鱼45d,于第45d及第60d分别采样,测定鱼体重和肝脏、脾脏、肾脏中一氧化氮(NO)含量及一氧化氮合酶(NOS)活性,研究中药复方对鲫鱼生长及免疫功能的影响。结果显示:45d时称量体重,复方AH、复方AB两组增重率显著高于对照组及其他三种中药复方组,饲喂60d对照组及所有中药组增重率均无显著差距。投喂45d,方剂AB显著降低鲫鱼肝脏、肾脏中NO的含量,五种中药方剂均能提高鲫鱼脾脏中NO含量。AH、AB、IV、APS四种方剂饲喂的鲫鱼肝脏中NOS含量明显高于对照组。投喂60天,五种中药方剂饲喂的鲫鱼脾脏中NO含量均高于对照组,除IV外,均差异显著。肝脏中NOS含量各组无显著差异,脾脏中IV组TNOS含量最高,APS组iNOS含量最高。肾脏中APS方剂组的iNOS含量显著高于对照组。     

恩诺沙星对嗜水气单胞菌的体外药效学研究

研究了恩诺沙星对嗜水气单胞菌体外药效学。主要包括:最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定、生长动力学曲线、杀菌动力学曲线、抗菌后效应、四种培养因子对恩诺沙星体外抑制嗜水气单胞菌活性影响的体外药效学研究。结果表明:MIC、MBC和MBC/MIC分别为0.16μg/mL、0.32μg/mL和2,嗜水气单胞菌在液体培养基中培养2h后进入对数期生长,大约持续10h;在用药4~8h时达到最大药效,由杀菌曲线可知恩诺沙星具有浓度依赖性;浓度为4MIC的抗菌后效应大于8MIC的对应值,但它们之间无显著差异(P0.05);恩诺沙星对嗜水气单胞菌作用的最适pH值为7~8;二价阳离子(Mg2+)对恩诺沙星药效影响较大;随着Mg2+浓度增大,药效降低;血清可降低恩诺沙星的药效;细菌数量对其抗菌活性影响不显著。     

两种微生态制剂对草鱼消化相关酶活性的影响

选用以枯草芽孢杆菌为主要成分的Ⅰ制剂及混合菌的Ⅱ制剂两种常用、商品化微生物制剂,对辽宁省池塘养殖草鱼进行投喂、泼洒和混合使用试验,并比较测定鱼肝脏、肠道组织中淀粉酶、蛋白酶及脂肪酶活性值.结果表明,以调节水质为主要作用的泼洒制剂Ⅱ对草鱼体内消化相关酶活性影响不大,但以促进消化生长为主要作用的投喂制剂Ⅰ对酶活性有较大促进...     

诺氟沙星在金鳟体内的药物代谢动力学研究

实验水温为15±2℃,金鳟（Oncorhynchus mykiss）（平均体质量100±10g）单剂量肌肉注射30.0 mg/kg诺氟沙星后,应用高效液相色谱（HPCL）法于0.15,0.25,0.5,0.75,1,1.5,2,4,6,8,12,24,48,72 h测定了鱼血浆、肝脏和肾脏组织中药物的浓度,研究了诺氟沙星在金鳟组织中的分布及药物动力学规律。结果表明,诺氟沙星在金鳟体内吸收分布迅速,符合药物动力学一级吸收二室开放模型,但消除缓慢。诺氟沙星在金鳟血浆、肝脏和肾脏中的主要动力学参数如下：分布半衰期（T1/2α）分别为0.866、1.985、0.388h;消除半衰期（T1/2β）分别为31.369、36.402、30.975h;药时曲线下面积（AUC）分别为：308.005μg/mL.h、622.721μg/g.h、794.362μg/g.h。     

传染性造血器官坏死病灭活疫苗的制备及免疫保护效果

为了研发用于预防传染性造血器官坏死病(infectious hematopoietic necrosis,IHN)灭活疫苗,实验以不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)在胖头鱥上皮细胞(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC)上对传染性造血器官坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)进行连续传代培养,通过测定各代病毒滴度,结合病毒收获时间确定最佳增殖方案;采用不同浓度的β-丙内酯(β-propanolactone,BPL)在24℃下灭活,经安全性实验验证后确定最佳灭活条件。以不同剂量腹腔注射免疫虹鳟,以磷酸盐缓冲溶液(PBS)为阴性对照组,通过检测攻毒后相对免疫保护率(relative percent survival,RPS)、免疫相关因子表达量及血清中和抗体效价来分析该疫苗的保护效果。结果显示,最佳增殖方案为以MOI为0.000 1接种,15℃培养3 d;最佳灭活条件为以终浓度3.0 mmol/L的BPL将IHNV在24℃下灭活24 h;以最佳免疫剂量10μL/尾腹腔注射免疫虹鳟,免疫后7、21、45和60 d的相对免疫保护率分别为91.37%、84.28%、84.15%和47.5%,免疫后60 d时RPS显著低于其他时间点免疫组;免疫相关基因的实时荧光定量PCR(realtime quantitative PCR,RT-qPCR)结果显示,与阴性对照组相比,Mx-1和IFN-γ表达量在免疫后7、15和30 d脾脏和头肾中均显著上调,在第7天时达到最大值(5倍);CD4和IgM表达量在免疫后15 d脾脏和头肾中均显著上调;在免疫后第30、45和60天虹鳟血清IHNV中和抗体效价依次为67.25、43.40和29.78,呈下降趋势且各组间差异显著。研究表明,该灭活疫苗可诱导虹鳟产生特异性免疫和非特异性免疫反应,对虹鳟具有显著的免疫保护作用。本研究为IHNV灭活疫苗研发提供参考。     

乳酸环丙沙星对鲤鱼肠道菌群的影响

研究表明 ,在正常情况下鱼类肠道内存在着大量的细菌群落 [1] ,这些细菌群落是动物长期进化的结果 [2 ] ,它们和动物的免疫功能、营养需求都有着极其密切的关系 [3 ,4] 。在水产养殖中 ,由于鱼病的发生而造成许多重大的经济损失 ,为了减少这种损失 ,各种抗菌药物被大量的使用 ,但是如果这些药物不被科学合理的应用 ,往往就会造成被应用动物的肠道菌群失衡 ,而引起新的疾病。由于抗菌药物的不合理应用造成肠道疾病的病例在人医和兽医上已有不少文献的报道[5,6] 。乳酸环丙沙星是第三代喹诺酮类药物 ,目前已被广泛应用于人医和兽医临床 ,并且…     

俄罗斯进口明太鱼中检出棘头虫

2001年绥芬河出入境检验检疫局从俄罗斯进口的明太鱼中检出棘头虫,虫体感染率为100%.感染强度为1～16.检出部位在胃、肠道内和肠道外,感染率分别是胃5.26%,肠道内84.21%,肠道外5.26%.     

喹乙醇对鱼类毒性作用的研究Ⅰ饲料中添加不同剂量喹乙醇对鲤鱼的生长及肠道菌群的影响

研究了饲料中不同剂量喹乙醇对鲤鱼生长、肠道菌群数量及组成的影响.设计6组不同喹乙醇含量的饲料(0,200,400,800,1 600和3 200 mg·kg-1),对鲤鱼进行84 d的饲养试验.试验结束时,各组随机取2尾鱼,分别对其前、中、后肠的细菌数量和组成进行了分析.结果发现,喹乙醇添加剂量在200～800 mg·kg-1可明显促进鲤鱼的生长并提高饲料转化效率,在3 200 mg·kg-1时则对其生长产生明显的抑制作用,且降低饲料转化效率.与对照组相比,投喂喹乙醇的试验组鱼肠道菌群数均有不同程度的下降,其中1 600,3 200 mg·kg-1组的下降最为明显.从1 600 mg·kg-1开始前肠菌群数明显下降,在400 mg·kg-1时中肠菌群数开始下降较为明显,后肠群数在各试验组均呈下降趋势.在对照组检出的7种主要菌群也是构成各个实验组鱼肠道中的主要菌群,但这7种菌群在各组中的组成比例不同,其中鲤鱼肠道菌属中Aer属、Aci属的组成比例变化较大,800 mg·kg-1(11.06%)、1 600 mg·kg-1(11.735%)和3 200 mg·kg-1(7.407%)组中Aer所占比例明显低于对照组(26.255%),而800mg·kg-1(37.502%)、1 600 mg·kg-1(36.52%)和3 200 mg·kg-1(41.357%)组中Aci所占比例明显高于对照组(13.213%).提示饲料中添加不同水平的硅乙醇可明显影响鲤鱼的生长性能及其肠道主要菌群的数量和组成比例.