几种氟喹诺酮类药物对嗜水气单胞菌体外药效学研究

采用试管两部稀释法测定了盐酸环丙沙星、乳酸环丙沙星、恩诺沙星、单诺沙星、二氟沙星对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度 (MIC)和最小杀菌浓度 (MBC) ,MIC分别是 :0 .0 0 6 2 5 ,0 .0 0 6 2 5 ,0 .0 12 5 ,0 .0 5 ,0 .2 0 ︼g.m L- 1 ,MBC分别是 0 .0 2 5 ,0 .0 2 5 ,0 .0 5 ,0 .10 ,0 .80 ︼g.m L- 1。同时研究了不同药物浓度 (2 MIC,5 MIC,8MIC)对嗜水气单胞菌杀菌的经时变化规律。结果表明 ,这几种药物从 2 MIC到 5 MIC浓度在 3h内菌数减少的 1g值之间差异显著 (P <0 .0 5 ) ,从 5 MIC浓度到 8MIC浓度在 3h内菌数减少的 1g值之间差异不显著 (P >0 .0 5 )     

5种中草药作为饲料添加剂对鲤肠内细菌及生长的影响

将5种常用中草药黄芩Scutellaria baicalensis Georgi、板兰根lsatis indigotica Fort、黄芪Astragalus membranaceus Fisch、茯苓Poria cocos Wolf及鱼腥草Houttuynia cordata Thunb作为饲料添加剂饲喂鲤Cyprynus(cyprynus)carpio,研究了这几种中草药对鲤的生长、肠内细菌数量及组成的影响。饲养25d后称重,每组随机取3尾鱼,分别对其前、中、后肠的细菌数量和组成进行了分析。结果发现,饲料中添加黄芩及黄芪可明显促进鲤的生长,并提高了饲料转化效率;添加茯苓、鱼腥草及板兰根也有一定作用,经统计分析表明差异不显著。投喂5种中草药均使鲤肠内细菌数增加,并对其组成产生影响,试验组出现了对照组所没有的芽孢杆菌属及棒杆菌属细菌,并且使优势菌群的组成发生了改变,不动细菌属明显增加,芽孢杆菌属所占的比率也在10％以上,而气单胞菌属、邻单胞菌属、假单胞菌属、弧菌属及肠杆菌科细菌数量则明显下降。另外,饲料中添加中草药可明显改变肠道细菌组成及数量,使有益菌类增加,并抑制大部分条件致病菌的生长。     

喹乙醇对鲤的消化酶活性及白细胞吞噬功能的影响

对7组1龄鲤Cyprinus carpio L分别饲喂添加不同剂量的喹乙醇饲料(0、100、200、400、800、1600、3200mg／kg)。于试验的第3、6、9、12周末,从每组随机抽取4～5尾鱼采取血样,测定肝胰脏及肠道中蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性以及血液白细胞吞噬指数、吞噬率、头肾／体重等指标,评价喹乙醇对鲤消化能力和非特异性免疫功能的影响。结果表明,当喹乙醇的添加剂量为100～800mg／kg时,鲤蛋白酶活性被诱导;剂量为1600～3200mg／kg时,鲤蛋白酶活性则被抑制。淀粉酶活性在不同喹乙醇剂量下被明显诱导。试验前期,中低剂量的喹乙醇可诱导脂肪酶活性,而较高剂量却抑制其活性;试验后期,喹乙醇对鲤脂肪酶活性的影响不明显。喹乙醇对鲤血液白细胞吞噬指数、吞噬率及头肾体重比没有明显的影响。这说明喹乙醇对鲤消化酶活性的影响较大,而对非特异性免疫功能及免疫器官的发育则没有影响。     

一株传染性造血器官坏死病病毒的致病性研究

为了对分离于山东某虹鳟养殖场的一株传染性造血器官坏死病毒株(IHNV-Sn1203)进行致病性检测与研究,将该IHNV-Sn1203毒株进行虹鳟鱼苗人工回接感染实验。结果显示,8d内人工感染实验鱼累计死亡率高达100%。收集大批濒死的病鱼样本,制备病理组织切片;利用鲤上皮细胞(EPC)进行细胞感染实验、病毒电镜观察、空斑实验、病毒滴度检测和聚类分析。病理组织切片显示,该病毒可造成虹鳟造血器官广泛性坏死;细胞感染实验结果显示,接种24 h后EPC细胞出现葡萄串状典型细胞病变(cytopathic effect,CPE),72 h后大部分细胞崩解脱落形成网状孔洞;电镜下清晰可见弹状病毒粒子大量存在于细胞质内,其在EPC细胞上的滴度为108.36TCID50/mL,并能形成2~4 mm空斑。对病毒核蛋白氨基酸序列的聚类分析结果显示,该病毒与标准毒株RB-1和WRAC的同源性分别为97%和93%,与国内报道的zyx株具有最高的同源性(99%)。研究表明,IHNV-Sn1203毒株能够在鱼体及敏感细胞中稳定繁殖,产生典型病变,具有较高的病毒滴度,对虹鳟鱼苗有很高的感染性和致死性。     

大蒜素在鲤、鲫血浆中的药物代谢动力学研究

建立鲤(Cyprinus carpio specularis)、鲫(Carassius auratus)血浆中大蒜素含量的气相色谱检测方法,并研究大蒜素在鲤、鲫体内的药物代谢动力学特征。对鲤、鲫以7.5 mg/kg的剂量单次口灌大蒜素,于停药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24、36、48、72 h采集血浆,采用气相色谱法(GC)检测药物含量,通过DAS3.0软件分析药动学参数。结果显示:二烯丙基二硫醚(DADS)和二烯丙基三硫醚(DATS)的最低检测限均为10 ng/m L,DADS、DATS在鲤血浆中的平均回收率分别为77.05%~97.98%、73.39%~108.51%,在鲫血浆中的平均回收率分别为87.05%~95.68%、83.69%~102.75%。药物的两种主要成分在健康鲤鲫体内吸收较完全,分布广泛,DADS较DATS吸收快,消除慢。     

虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗工程菌发酵工艺研究

急性传染性造血器官坏死病(infectious hematopoietic necrosis,IHN)严重威胁虹鳟Oncorhynchus mykiss养殖业,造成严重的经济损失,核酸疫苗已成为虹鳟IHN疾病预防的研究热点。本研究首先检测虹鳟IHN核酸疫苗工程菌的遗传稳定性,结果显示工程菌在连续培养30代后,仍能保持稳定的质粒拷贝数。质粒酶切结果表明:连续培养30代后的质粒依然保持良好的完整性。在筛选高拷贝工程菌的基础上,又研究核酸疫苗的高密度发酵培养基、补料及发酵时间。结果表明:最优的发酵培养基配方为:1.2%胰蛋白胨(Tryptone)、2.4%酵母提取物(Yeast Extract)、0.5%甘油、0.017 mol·L~(-1)KH_2PO_4、0.072 mol·L~(-1)K_2HPO_4;补料配方为:3%胰蛋白胨、1.5%酵母提取物、50%甘油,最佳发酵时间为16h。本研究可为虹鳟IHN核酸疫苗的规模化生产提供参考。     

哲罗鲑胰岛素样生长因子-I的原核表达及活性鉴定

为进一步了解哲罗鲑IGF-I,实验采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从哲罗鲑肝脏的总RNA中扩增出胰岛素样生长因子-I(IGF-I)的c DNA开放阅读框(open reading frame,ORF)序列。利用原核表达载体p S构建重组表达质粒(IGF-I/p S),并将其转化到宿主大肠杆菌Rosetta后经IPTG诱导获得重组哲罗鲑IGF-I蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,在35~50 ku有条带与预期相符,且重组蛋白以包涵体的形式存在。包涵体经变性/复性实验后,获得纯化的IGF-I融合蛋白。ELISA鉴定结果显示,目的蛋白能特异性识别抗鱼类IGF-I抗体,表明获得了具有免疫活性的哲罗鲑IGF-I蛋白。细胞增殖实验(MTT法)结果显示,重组IGF-I蛋白对大麻哈鱼胚胎细胞(CHSE-214)、鲤上皮细胞(EPC)及虹鳟性腺细胞(RTG-2)均有显著促增殖作用,表明获得的重组IGF-I蛋白具有细胞水平的生物活性。本研究为深入了解IGF-I在哲罗鲑生长发育中的调控机制及绿色高效促生长制剂的研发奠定基础。     

鱼类传染性造血器官坏死病毒糖蛋白的酵母表面展示

糖蛋白(glycoprotein,G)是鱼类传染性造血器官坏死病毒的主要表面抗原,是病毒检测及疫苗研制的主要靶基因。为了对其进行酵母表面展示,本研究利用本实验室保存的含有IHNV-Sn1203毒株G基因的质粒为模板,PCR扩增富含抗原表位的糖蛋白基因片段后,连接酵母表面展示载体p YD1,构建重组质粒p YD1-G。将p YD1-G转化酿酒酵母EBY100细胞后,利用半乳糖诱导G蛋白的表达。利用细胞免疫荧光、Western Blotting及流式细胞仪检测酵母表面G蛋白的表达情况。细胞免疫荧光结果显示,转化了p YD1-G重组质粒的酵母细胞表面呈现出特异性荧光;Western Blotting结果显示,经半乳糖诱导后G蛋白在酵母细胞表面获得了成功表达;流式细胞仪检测结果表明,随着半乳糖诱导时间的增加,G蛋白的表达量随之增加,并在诱导48 h时达到峰值。以上研究表明G蛋白在酵母细胞表面获得了成功表达,本研究为以酵母为活载体的新型口服疫苗的研制奠定了基础。     

三种助溶剂对氟苯尼考水溶液助溶效果的比较研究

氟苯尼考是一种新型动物专用氯霉素类广谱抗菌药,在畜禽及水产动物细菌性疾病的防治中应用较广。而其在水中溶解度小,所配药液浓度低,长时间贮存稳定性差,使用极其不便。本实验摸索了常用的二甲基亚砜、甲醇、乙醇三种助溶剂在不超过70%添加量下促进氟苯尼考水溶液所能达到的最大浓度,观察了在低温（4℃）、常温（20℃）和高温（30℃）下药物的稳定性,通过抑菌实验检测了助溶剂对药物抑菌效果的影响。结果表明：二甲基亚砜助溶效果最好,对药效影响最小,可作为氟苯尼考水溶制剂的首选助溶剂。甲醇最大可促进氟苯尼考溶液达到2%,乙醇仅为0.7%,两者对药物抑菌效果影响较大,但可增强药液在低温下的稳定性,长时间放置（7d）无药物析出。     

氟苯尼考及氟苯尼考胺在鲤体内的残留

在水温(18±1)℃下,采用高效液相色谱串联质谱法研究了氟苯尼考及其主要代谢物氟苯尼考胺在体质量(100±10)g鲤(Cyprinus carpio)体内的代谢及残留规律,以制定休药期。实验鱼间隔24h按15 mg.kg-1体质量的剂量口灌给药,连续给药3次,在给药后0.5h、1 h、2h、4h、8h、12h、24h、2d、3d、5d、7d、10d、15d、20d检测肌肉、皮肤内氟苯尼考和氟苯尼考胺的含量。结果表明:氟苯尼考在鲤体内的代谢速度快,2~4 h出现峰值;肌肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺的残留浓度高于皮肤,肌肉和皮肤中氟苯尼考的含量均高于氟苯尼考胺,皮肤中的代谢速度较快。按欧盟标准相应的休药期不少于2d,按日本标准则不少于10 d。