6个鹅种GH基因单核苷酸多态性检测及群体遗传分析

确定鹅GH基因编码区是否存在单核苷酸多态性,并分析其在不同品种群体中的频率分布,为进一步探讨该基因与鹅生产性能关系而奠定基础.以太湖鹅、扬州鹅、豁眼鹅、浙东白鹅、皖西白鹅和四川白鹅6个鹅品种为试验材料,根据鸭、鹅GH基因序列设计了3对引物,分别扩增第3、4、5外显子,用PCR-SSCP方法进行单核苷酸多态性分析,并对不同品种群体进行群体遗传学分析.结果在引物2扩增片段上共检测到3个基因型(HH、HI和II),经过克隆测序比较发现2个单碱基突变,均为沉默突变,分别为编码区的T291C、G297A.统计结果发现3种基因型在6个鹅品种间分布存在极显著的差异(P<0.01).所有品种均处于Hardy-weinberg平衡状态.群体遗传分析表明豁眼鹩杂舍度、有效等位基因数、多态信息含量最低,浙东白鹩最高;所有鹅种均处于中度多态.表明鹅GH基因不同品种中具有丰富的单核苷酸多态性,可以进一步作为候选基因来分析其与产肉性状的相关性.     

牛气管抗菌肽在毕赤酵母中的表达及条件优化

根据已发表的牛气管抗菌肽(bTAP)序列和酵母密码子偏爱性设计并合成一段bTAP DNA序列,将其与毕赤酵母pPIC9K质粒连接后构建了分泌表达载体pPIC9K-bTAP.获得重组质粒经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选获得了阳性转化重组菌.通过对重组菌培养条件的进一步优化,揭示了重组...     

新鱼腥草素钠对鸡外周血T淋巴细胞增殖的影响

采集健康鸡肝素抗凝血,按常规方法分离外周血淋巴细胞并于体外培养24 h后,加入不同剂量的新鱼腥草素钠/刀豆素A(ConA),继续培养44 h后,以MTT法测定新鱼腥草素钠对淋巴细胞增殖的影响。结果表明,新鱼腥草素钠在体外具有刺激淋巴细胞增殖的能力,且与ConA具有协同作用;进一步分析表明,不同给药剂量的新鱼腥草素钠对淋巴细胞的影响不同,其中以终浓度为250 mg/L效果最明显。     

鸡白细胞介素2对La Sota弱毒苗免疫效果促进作用的初步研究

为研究鸡白细胞介素2对新城疫La Sota弱毒苗免疫效果的促进作用,纯化真核重组质粒pcDNAChIL-2,细胞转染验证后,将重组质粒分为0,5,10,20和30μg 5个剂量组,分别与LaSota弱毒苗同时免疫7日龄雏鸡,免疫后7d,每隔1周分离鸡血清,测量血清中NDV的HI效价.结果表明,混合注射有pcDNAChIL-2重组质粒雏鸡的NDV抗体产生的水平显著升高,其中以20和30μg剂量组最为明显,提示ChIL-2可有效促进La Sota弱毒苗的免疫效果.     

猪圆环病毒1型和2型衣壳蛋白的表达与鉴定

根据已经发表的猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白基因(Cap)分别设计一对引物,利用PCR方法从已知的PCV1和PCV2中各扩增到一条DNA片段.将PCR产物按预定的阅读框架插入表达性质粒载体pGEX-6p-1中的谷胱苷肽转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pCAP-PCV1和pCAP-PCV2,并分别转化大肠杆菌BL21.序列测定表明,所克隆的序列大小均为579 bp,其中PCV1的cap基因与GenBank中的U49186序列一致,PCV2的cap基因与DQ104422序列一致.通过对菌体裂解物的SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,证明携带重组质粒pCAP-PCV1或pCAP-PCV2的大肠杆菌均可以表达融合蛋白形式的衣壳蛋白(分别命名为GST-CAPl和GST-CAP2,分子量约为49 ku).通过免疫小鼠制备了GST-CAP1和GST-CAP2多价血清,并通过dot-ELISA进一步证明了PCV1与PCV2的抗原交叉性.猪圆环病毒衣壳蛋白的表达,将为临床检测PCV抗体提供诊断抗原以及为研制PCV单克隆抗体提供材料.     

重组鸭α-干扰素的表达与鉴定

根据大肠杆菌密码子的偏好性,试验对GenBank中已经发表的鸭α-干扰素基因序列进行密码子优化,人工合成后构建原核表达质粒pET30a-DuIFNα-ELP;将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达制备DuIFNα-ELP;通过SDS-PAGE切胶方法得到纯化的DuIFNα-ELP;纯化产物免疫小鼠后收获血清,用Western blotting验证免疫血清的特异性,并用ELISA法检测其特异性抗体滴度。根据类弹性蛋白多肽(ELP)温度敏感的可逆相变特性,通过重复可逆相变循环(ITC),在高盐离子浓度和临界温度下纯化重组蛋白,并采用微量细胞病变抑制法在MDCK/VSV系统中检测重组蛋白的抗病毒活性。结果表明:合成的重组鸭α-干扰素基因能成功表达,重组蛋白DuIFNα-ELP约80 ku,免疫小鼠可产生特异性抗体,抗体效价为1∶1000000。抗病毒试验检测重组DuIFNα-ELP的抗病毒活性为1.0×106U/mL,比活性为1.25×106U/mg。这一结果为研制广谱、安全、高效的基因工程鸭α-干扰素提供参考,也为检测体内外DuIFNα的表达奠定了基础。     

定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒游离受体夹心ELISA方法的建立与应用

为了建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）游离受体定量检测方法,本试验用表达猪唾液酸黏附素（Sn）游离受体的重组腺病毒rAd-Sn4D-Fc感染PK-15细胞,以细胞培养上清纯化的Sn4D-Fc游离受体作为标准抗原,鼠抗猪Sn免疫血清为一抗,生物素标记兔抗猪Sn多克隆抗体为二抗,建立定量检测Sn4D-Fc游离受体的双抗体夹心ELISA方法;用rAd-Sn4D-Fc注射仔猪,定期采集血清进行游离受体检测。结果显示,纯化Sn4D-Fc标准抗原的纯度为94.3%,能被Sn免疫血清识别;一抗的最佳工作浓度为5 μg/mL蛋白,二抗的最佳稀释度为1：4 000,夹心ELISA检测标准抗原的灵敏度为0.4 ng/mL,对照抗原无交叉反应;夹心ELISA能从重组腺病毒注射猪血清中检测到Sn4D-Fc游离受体,最高表达量为6.54 ng/mL,持续时间为15 d。研究结果表明,建立的双抗体夹心ELISA可用于PRRSV游离受体的体内外定量检测。     

大肠杆菌F18菌毛E亚单位基因克隆与序列分析

根据已发表的F18ab菌毛E亚单位的基因序列(fedE／ab)，设计1对引物，利用PCR技术从10株大肠杆菌(F107／86、YCED1、YCED2、C、D、E、12F、2134P、8199、8813)中分别扩增到1个片段，并克隆至pGEM-T载体，获得重组质粒TF107E、TYCED1E、TYCED2E、TCE、TDE、TEE、T12FE、T8813E、T8199E、T2134PE。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明，这10个片段大小均为516bp。通过与已发表的fedE／ab序列进行比较，发现这10个菌株的fedE序列高度同源，其中F107／86、YCED2、C、D、E、8813、8199、2134P的fedE序列完全相同，只有YCED1株在第45位碱基处存在1个G—A转换、12F株在第316位碱基处存在1个G—A转换。这说明F18ab和F18ac菌毛的fedE基因相同，fedE是F18菌毛的保守性亚单位。     

HPLC-ELSD法测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量

采用高效液相-蒸发光散射检测器法(HPLC-ELSD)测定免疫佐剂——三七总皂苷中三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1的含量,色谱柱Discovery C18(250 mm ×4.6 mm,5μm),采用梯度洗脱,流动相为水-乙腈,流速为1.0 mL/min,柱温30℃.结果显示,三七皂苷R1含量5.19％,人参皂苷Rb1含量32.19％,人参皂苷Rg1含量41.28％,3种皂苷含量之和为78.66％.说明该方法简便、快速、重现性好,可用于控制三七总皂苷的质量.     

三七总皂苷β-环糊精包合物稳定性研究

考察免疫佐剂——三七总皂苷(PNS)β-环糊精包合物的稳定性.采用比色法,以PNS含量为指标,分别对PNSβ-环糊精的包合物和混合物进行强光照射、高温、高湿、恒温加速试验.结果表明:在光、热、湿等因素影响下,包合物中PNS含量没有明显变化,而混合物中PNS含量明显下降,包合物的热失重百分率比混合物小.说明PNSβ-环糊精包合物具有一定的抗光照性、热稳定性和湿稳定性,其稳定性明显优于单纯PNS.