光皮桦木质部cDNA-AFLP 技术体系的建立及应用

为了挖掘光皮桦材性相关基因,本研究以光皮桦木质部为材料,通过对RNA 的提取、cDNA 的反转录及纯化 的对比分析,以及选扩体系优化等,建立了相应的cDNA-AFLP 体系。结果表明:采用CTAB 和RNAiso 试剂相结合 的方法得到的RNA 质量较好,cDNA 经纯化后选扩效果明显变好。选扩体系为:4.0 μL 预扩产物(稀释40 倍)、1.6 μL 的引物(10.0 mmol/ L)、0.2 μL 的dNTP(2.5 mmol/ L)、0.4 μL 的Mg2 + (25.0 mmol/ L),以及0.2 μL 的Taq DNA 聚合酶(5 U/ μL)。进一步以来自不同木质化茎段的cDNA 为模板,筛选出31 对扩增效果较好的引物组合,同时分 离出一些差异表达的基因片段,经测序后探讨了其在木质化发育过程中可能的功能。      

香榧雌花芽部分内源激素的HPLC分析及动态变化

以香榧Torrega grandis'Merrillii'雌花芽为材料,研究了芽体中内源吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)的提取、纯化方法和色谱测定条件.结果发现以石油醚作萃取剂,并结合添加水不溶性聚乙烯吡咯烷酮和过Sep-PakC18小柱处理可达到较好的提纯效果.采用ODS-C18反相柱和Waters 486型紫外检测器.用甲醇-水(体积比为50:50,用乙酸调节pH为3.0)作流动相,流速为1 mL·min-1,柱温设为25℃,进样量20 μL,分离IAA和ABA时紫外检测波长为280 nm.分析GA3时紫外检测波长为210 nm,选用外标法进行定量.测定结果显示:该方法回收率高,重演性好,符合痕量分析要求.从2004年2月21日至4月29日的香榧雌花芽分化过程中,芽体中IAA和GA3的质量分数呈现先上升后下降的变化趋势,而ABA的质量分数表现出"上升-略下降-再明显上升"的变化.图4表4参11     

杉木叶片原生质体分离及RNA提取体系的建立

【目的】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分析不同因素对杉木原生质体分离的影响,建立杉木叶片原生质体分离体系,以期为杉木基因功能验证提供有效的技术平台;比较不同RNA提取方法,筛选获得杉木原生质体总RNA提取的有效方法,为今后利用杉木原生质体开展分子生物学研究提供技术支持,也可为其他林木原生质体的总RNA提取研究提供参考。【方法】选取杉木组培苗最上端未分轮的幼嫩叶片为材料,通过分析5种不同酶组合、真空处理时间(0、5、10、15、20 min)、渗透压(0.3、0.4、0.5、0.6 mol·L-1甘露醇)、BSA浓度(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)及酶解时间(1、2、3、4、5 h)5个条件,进行杉木叶片原生质体的分离。采用改良Trizol法、改良Trizol+10μg糖原法、CTAB-Li Cl法、CTAB-Li Cl+10μg糖原法、改良CTAB-异丙醇法、改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法、天根RNA提取试剂盒法共7种方法提取杉木原生质体RNA,通过杉木内参基因和2个特异基因进行RNA质量验证,比较不同方法的提取效果。【结果】在1.5%纤维素酶R-10、1%离析酶R-10、0.2%果胶酶Y-23、0.5 mol·L-1甘露醇以及0.3%BSA的混合酶液中,真空处理10 min,酶解2 h,可分离出高活力的纯净杉木原生质体,其产量可达到7.27×106个·g-1,活力可达到94%。7种方法皆能提取出杉木叶片原生质体的总RNA,但不同方法间存在明显差异,其中改良Trizol法、改良Trizol+10μg糖原法、改良CTAB-Li Cl法、改良CTAB-Li Cl+10μg糖原法提取的RNA有不同程度的降解现象,其余方法所提取的RNA完整性较好,且OD260/280和OD260/230值均在1.8~2.0范围内;在RNA得率方面,改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg,分别是改良CTAB-异丙醇法和天根RNA提取试剂盒法的1.73倍和1.58倍;综合考虑,改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法提取杉木原生质体RNA的效果最好。【结论】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分离条件为纤维素酶R-10浓度1.5%、离析酶R-10浓度1%、果胶酶Y-23浓度0.2%、甘露醇浓度0.5 mol·L-1、BSA浓度0.3%,真空处理10 min,酶解2 h,可大量获得高质量的杉木原生质体;利用改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法,可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg。研究结果为杉木重要性状关键基因的功能研究及其在育种中的应用提供了重要基础。     

光皮桦茎叶cDNA文库构建及部分EST序列SSR分析

以光皮桦茎叶组织为材料,构建了cDNA文库。初级文库滴度为1.5×106pfu/mL,重组率达97.3%,插入片段大小在0.5～3.0 kb之间,平均长度约为1.3 kb,表明所构建的文库质量较高,可用于后续基因克隆及基因表达谱的研究。利用微卫星查找软件对获得的224条EST序列进行微卫星位点搜寻及其丰度、分布比较,发现47条序列含微卫星位点60个,占全部EST序列的26.80%;在所有SSRs中二碱基重复最多,为42个,占总数的70.00%,含三、四碱基重复分别占总数的28.30%和1.70%。通过对光皮桦EST序列中微卫星位点信息的发掘分析,为有针对性地设计EST SSR引物、进行遗传多样性分析奠定了基础。      

光皮桦光合特性的研究

为揭示光皮桦光合特征,以浙江省的临安无性系、丽水无性系和广西壮族自治区的龙胜无性系3个光皮桦无性系幼株为试验材料,利用LI-6400P便携式全自动光合测定仪,于2010年10月测定了3种试验材料的光合日进程、光合-光响应过程、光合-CO2响应过程.结果表明,光皮桦净光合速率日变化呈单峰和双峰2种类型,临安无性系存在光合“午休现象“,临安无性系、丽水无性系的净光合速率均与龙胜无性系存在显著的差异(P＜0.05),而临安无性系与丽水无性系之间差异不显著(P＞0.05);丽水无性系的气孔导度显著高于临安无性系与龙胜无性系(P＜0.05),而临安无性系和龙胜无性系之间的气孔导度值差异不显著(P＞O.05);3个无性系的光饱和点变化范围在1 342.8～1 609.0μmol/(m2·s),光补偿点在18.1～27.2 μmol/(m2·s),表观量子效率在0.035～0.047;CO2饱和点变化范围在2 000.7～2 350.7μmol CO2/mol,CO2补偿点在61.5～76.7 μmol CO2/mol,羧化效率在0.027～0.040.逐步回归分析表明,临安无性系和丽水无性系净光合速率的主要影响因子是光合有效辐射,龙胜无性系则主要受蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度的影响.     

红叶石楠硬枝水培生根试验

红叶石楠Photinia frasery扦插繁殖,插条生根时间长,生根率偏低,影响其生产性大规模繁殖.采用多因素试验设计研究了不同培养液、3种生长调节物质(自制生根剂、NAA和ABT)的不同浓度对红叶石楠硬枝水培生根的影响,以寻找最适生根条件.结果表明红叶石楠插条生根为愈合组织型生根,其生根率受培养液种类、生长调节物质种类及浓度极显著影响.在所设计的组合中,以清水+自制生根剂10mg·L-1、清水+ABT5mg·L-1和营养液+自制生根剂10mg·L-1生根效果较好,生根率分别为100%,93.3%和91.7%,并对培养过程中不同阶段如何调整培养液种类和生长调节物质浓度及添加生长调节物质种类的选择提出了建议.表4参8     

不同施钾水平甘薯直链淀粉含量和糊化特性的基因型差异

应用粘度速测仪分析了两种钾肥水平下的甘薯淀粉糊化特性.结果表明,甘薯全粉RVA谱表现为B型和C型.崩解值的基因型差异最大,且与P时间呈极显著负相关(r=-0.71**).淀粉率与最高粘度和崩解值之间有显著(r=0.59*)和极显著(r=0.74**)正相关;直链淀粉含量与崩解值呈极显著正相关(r=0.89**).施钾对淀粉糊化特性没有显著影响,说明改变淀粉品质的关键因素是基因型,不是钾肥处理.     

光皮桦成花相关MADS-box基因BlMADS1的克隆与表达

MADS-box家族基因广泛分布于植物中,在花发育过程中起着重要调控作用。采用同源克隆结合c DNA末端快速扩增技术(RACE)在光皮桦Betula luminifera中克隆到1个MADS-box基因,命名为Bl MADS1。该基因可能存在2个不同的转录本Bl MADS1S和Bl MADS1L:前者为1 150 bp,编码254个氨基酸,具有MADS-box基因的典型结构,与欧洲白桦Betula pendula的同源基因相似性最高(97%);后者长1 312 bp,但仅含有690 bp的开放阅读框(ORF),编码229个氨基酸,缺失MADS-box蛋白的C端。这种缺失可能由内含子可变剪切造成。同源比对和系统进化分析表明:Bl MADS1属于AP1/SQUA亚家族的AGL79这一分支。定量聚合酶链式反应(PCR)表达分析表明:Bl MADS1基因在根、茎、叶和花器官中均有表达,但Bl MADS1S和Bl MADS1L这2个转录本表达模式存在差异。雄花序发育过程中,Bl MADS1的2个转录本的表达峰值均在萌动雄花序时期;而在雌花序发育过程中,Bl MADS1L和Bl MADS1S表达水平的峰值分别出现在初生雌花芽和萌动雌花序。图6表1参27     

天目铁木雄花序内源多胺的HPLC分析及其动态变化

采用高效液相色谱法(HPLC)对天目铁木不同时期的雄花序3种内源多胺—腐胺(Put)、精胺(Spm)、亚精胺(Spd)进行测定分析。结果发现:(1)适宜的苯甲酰化反应条件为37℃、30 min。(2)将色谱条件设定为检测波长254 nm,流动相配比甲醇︰水为60:40,流速0.6 mL.min-1,柱温30℃,进样量5μL。在该条件下内源多胺出峰和分离效果最佳。(3)在采样期间,雄花序中Spd含量最高,Spm次之,Put最少,且3种内源多胺含量均呈先升高后降低趋势,变幅明显。采用优化的HPLC法可有效快速地测定天目铁木雄花序的内源腐胺、精胺和亚精胺,并初步揭示了雄花序发育过程中3种内源多胺的变化趋势。