光皮桦BlBLH1基因的克隆、表达及互作蛋白筛选

【目的】BLH基因家族是广泛存在于植物中的转录因子,其与KNOX等转录因子的互作被认为在植物的次生壁发育中起重要调控作用。本研究拟克隆光皮桦BlBLH1基因,分析其表达模式,并筛选能与其互作的蛋白。【方法】利用Blast等软件在光皮桦基因组序列中鉴定获得BlBLH1序列,克隆验证后对其进行多序列比对、系统进化等生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR分析BlBLH1在光皮桦不同组织、器官和应拉木形成中的表达模式;通过酵母双杂交技术筛选BlBLH1互作的蛋白,并采用双分子荧光互补实验(BiFC)进一步验证其与部分蛋白在拟南芥细胞内的互作。【结果】BlBLH1基因序列全长为2 128 bp,开放阅读框(ORF)为1 830 bp,编码609个氨基酸,具有SKY、BEL和HD 3个保守结构域。系统进化分析显示,BlBLH1与拟南芥BLH1有最近的同源关系。表达分析显示BlBLH1在雄花序中的表达量最高;在木质化茎段中的表达量次之;在应拉木诱导过程中,BlBLH1在应拉木中的表达量均显著高于对照。通过酵母双杂交筛选获得结构蛋白、酶、转录因子等47个与BlBLH1互作较强的蛋白;BiFC验证结果表...     

杉木应压木木质部细胞形态特征及主要代谢成分表征

为探讨主要代谢成分与应压木形成的关系,以拉弯诱导形成的杉木应压木为材料,在明确其重要显微特征、木质素含量的基础上,运用气相色谱质谱联用系统(GC-MS)对主要代谢成分进行了鉴定和相对表达丰度分析。结果表明:杉木应压木管胞多以椭圆形呈现,且管胞壁明显增厚。应压木管胞平均长度和宽度分别为1 347.34和20.18 μm,均显著小于对应木;平均壁腔比为0.43,显著大于对应木。应压木木质素的相对含量较对应木增加21.9%。在3个拉弯时期皆可鉴定出18种代谢成分,其中有机酸5种、单糖4种、二糖3种、醇类和氨基酸各2种、无机酸和内酯类各1种。时期Ⅰ应压木中果糖和葡萄糖含量与对应木差异不大,但这2种化合物含量均随拉弯时间延长呈现下降趋势,且时期Ⅱ、Ⅲ在应压木中的含量显著小于对应木,符合应压木纤维素含量下降的事实。应压木中与木质素合成相关的莽草酸含量呈上升趋势,其在时期Ⅲ应压木中的含量显著高于对应木,这解释了应压木中木质素含量明显多于对应木的现象。      

石蒜属植物种质资源ISSR-PCR反应体系的建立

为进一步开展石蒜属Lycoris植物种质资源遗传多样性研究,利用正交试验设计的方法,从Taq酶、Mg2 、模板DNA、dNTP和引物等5因素4水平,对石蒜属植物ISSR(intersimple sequence repeats)反应体系进行优化,确立了石蒜属植物ISSR的最佳反应体系:在20μL反应体系中,含1×Buffer,模板DNA 50 ng,2.5 mmol.L-1氯化镁(MgCl2),0.15 mmol.L-1dNTP,25.05 nkatTaq聚合酶,0.5μmol.L-1引物。进一步进行梯度退火试验,确定最适宜退火温度为57℃。图7表2参23     

近红外反射光谱法测定厚朴酚类物质

为了建立厚朴Magnolia officinalis药材品质快速有效的评价方法,采用近红外反射光谱技术测定厚朴酚及和厚朴酚的质量分数。通过在全波长条件下,运用不同数学预处理、光谱散射校正和统计方法对来发展定标回归方程,其中统计方法包括偏最小二乘法(PLS)、修正的偏最小二乘法回归分析法(MPLS)和主成分回归法(PCR)。在对比分析的基础上,得到最佳的数学方法为"3,6,6,1"组合,光谱散射校正方法为SNV D或SNV,统计方法为MPLS,厚朴酚类物质的定标决定系数RSQ均达到了0.97以上。该定标模型的外部独立检验相关系数也均达0.95以上。用近红外反射光谱技术测定厚朴药材酚类物质质量分数具有与化学法相近的准确性,可在实践中应用。图2表5参11     

紫楠转录组EST-SSR标记开发及通用性分析

紫楠(Phoebe sheareri)是商品材金丝楠木的原植物种之一,现存野生资源日益减少,为了进一步掌握其遗传多样性和遗传结构特征,大规模开发该种表达序列标签-简单重复序列(expressed sequence tag-simple sequence repeat,EST-SSR)标记迫在眉睫。本研究首次进行紫楠转录组高通量测序,挖掘SSR位点和开发EST-SSR标记,并进行引物的初步验证以及在楠属植物的通用性检测。结果显示,通过Illumina Hiseq 2500测序共获得43 781条Unigene,应用MISA软件鉴定了6 958个SSR位点,分布频率为15.89%,平均每5.31 kb出现1个SSR位点。紫楠SSR位点共包括340种重复基元,以二、三核苷酸为主,其优势重复基元分别为AG/CT(23.99%)和AAG/CCT(12.81%)。基于不同重复基元类型设计合成了94对SSR引物,以10份紫楠及同属4种楠木的基因组DNA为模板对其有效性及通用性进行初步验证,筛选出具有清晰扩增产物的引物41对,其中32对具有多态性,其平均等位基因数2.75个,观察杂合度(heterozygosity,Ho)、期望杂合度(heterozygosity,He)、多态信息含量(polymorphism information content,PIC)分别为0.369、0.563和0.541,且在同属材料中通用性较高。紫楠转录组测序获得的Unigene可作为SSR标记开发的有效来源,所获得的EST-SSR引物可为紫楠及楠属其他树种的遗传结构分析、种质资源利用及遗传图谱构建提供有效的分子标记。     

光皮桦BlSPL1转录因子基因的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

Squamosa promoter binding protein like genes(SPLs)对植物开花具有重要的调控作用.基于转录组序列并利用RACE技术从光皮桦中分离获得BlSPL1基因,其cDNA序列全长1 825 bp,包含开放阅读框长1 170 bp,编码389个氨基酸,与桃PpSPL1(EMJ10405)的同源性最高(67％),属于陆地植物SPLs基因家族的group VⅧ分支.表达分析显示BlSPL1在光皮桦芽、雌花、雄花、幼苗中均有表达,在雄花和幼苗中表达量较低,但在芽发育成雌花过程中明显上调,推测其可能对早期的雌花形成起调控作用.同时,从57个不同的光皮桦无性系中克隆BlSPL1的基因组序列,进行单核苷酸多态性(SNP)分析,共检测到98个SNP位点,SNP频率为1/26 bp,多样性指数π为0.007 12.在外显子区域,共检测到28个SNP位点,其中11个为同义突变,17个为错义突变.进一步的连锁不平衡分析显示,随着序列长度的增加,不同光皮桦群体BlSPL1内的SNPs连锁不平衡在基因内部迅速衰退.     

天然光皮桦树干生长特性初步研究

通过对7株天然光皮桦的树干解析,发现树高在前5年生长较慢,第5～25年增长较快;胸径生长在第10年后速度加快,可以持续到第40年左右,光皮桦的胸径生长可以维持较长的时间;材积在第20～30年后增长较快,可以持续到第50年仍保持较高水平的增长.同时发现单株间在树高总生长、平均生长、连年生长、胸径总生长、平均生长、连年生长、材积总生长、平均生长、连年生长、生长率和形数等均存在差异,这与各单株的遗传背景、立地条件和林分条件有关.     

矮生杉木光合特性及叶绿素荧光参数研究

为揭示杉木矮生的原因,以矮生杉木、正常杉木为材料,对其光合特性和叶绿素荧光参数进行了比较研究。结果表明:矮生型叶片的光补偿点和光饱和点分别为18.44和500 μmol/（m2·s）,正常型叶片相应值分别为7.32和1 500 μmol/（m2·s）,表明矮生型的光能利用能力明显不如正常型;在光合参数方面,矮生型叶片的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）及蒸腾速率（Tr）均低于正常型,但两者胞间二氧化碳浓度（Ci）差异不大,表明矮生型较低的净光合速率可能是非气孔限制的结果;对于叶绿素荧光参数,矮生型经充分暗驯化后的初始荧光（F0）、最大荧光（Fm）、PSⅡ内禀光能转换效率（Fv/Fm）及PSⅡ潜在活性（Fv/F0）几乎均小于正常型。因此,矮生杉木光合能力上的缺陷可能是造成低生长势的重要生理生态原因之一。      

杉木木质素合成酶基因CCR的克隆和序列分析

以杉木(Cunninghamia lanceolata)茎叶为材料,根据已报道的肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)基因保守区设计简并引物,采用RT-PCR结合RACE的策略克隆获得杉木CCR基因的全长cDNA(命名为CLCCR),该基因cDNA序列全长1 379 bp,具有一个975 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,简称ORF),编码324个氨基酸,序列分析表明:杉木CCR基因核苷酸序列与已报道的欧洲云杉(Picea abies,CAK18610.1)CCR基因具有87%的相似性;与其他植物氨基酸序列聚类分析显示杉木与松科植物欧洲云杉、马尾松(Pinus massoniana)、火炬松(P.taeda)的亲缘关系较近。     

厚朴AFLP分子标记体系的建立

以厚朴 Magnolia officinalis为材料,通过对扩增片段长度多态性（AFLP）反应体系中的酶切模板用量、扩增条件等几个方面进行优化,建立了较为理想的厚朴AFLP反应体系。结果表明：①采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）硅珠法提取的DNA质量较好,适用于AFLP分析。②酶切的基因组DNA以400 ng为宜;预扩增产物的稀释倍数以30倍为宜;20.00 μL选扩反应体系中Mg²⁺最佳浓度为2.00 mmol·L^－1,三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）最佳浓度为0.225 mmol·L^－1,Taq DNA 聚合酶最佳用量为16.67 nkat时,扩增带清晰且稳定,扩增效果较好。旨在为研究厚朴天然种群的遗传多样性及遗传结构分析、新品种选育及鉴定和遗传图谱构建等奠定理论基础。图7表1参12