杉木NAC转录因子基因ClNAC1的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

【目的】克隆与杉木次生壁形成相关的Cl NAC1基因,在组织表达特异性分析基础上开展该基因的单核苷酸多态性(SNP)及其连锁不平衡(LD)分析,以期为深入解析该基因功能和开展LD作图提供重要依据。【方法】基于杉木根、茎、叶等混合样本转录组测序获得的相关数据,分离杉木Cl NAC1的c DNA序列,进行同源比对和进化树构建分析。利用实时荧光定量PCR技术(q PCR)检测Cl NAC1的表达模式。通过MEGA 6.0和Dna SP 5.0分析Cl NAC1在40个杉木无性系的SNP变异,以及LD衰减程度。【结果】分离到Cl NAC1基因c DNA序列1 286 bp,开放阅读框(ORF)长度为1 092 bp,编码蛋白质在N端含有1个由128个氨基酸残基组成的NAC结构域。相应基因组序列长2 546 bp,有3个外显子和3个内含子,且第1个内含子位于5'非翻译区(UTR)。系统进化树分析表明,Cl NAC1蛋白位于B分支,与拟南芥的NST1/2/3、毛果杨的Ptr WND2A/B等聚在一起,属于次生生长相关的NAC转录因子类别。Cl NAC1在雄球花中的表达量最大,在当年生成熟叶中最小;该基因在当年生半木质化茎中的表达量是未木质化茎的2.8倍,且在去年生茎木质部中的表达量比皮层大3倍左右。利用来自6个地理种源的40个无性系发现Cl NAC1内存在104个常见SNP位点,平均发生频率为1/24 bp,多样性水平达到0.012 53。编码区域有32个SNP位点,其中25个属于同义突变,7个属于错义突变。SNP多样性指数πtot、πsil、πs、πn在6个群体间的差异不显著,且不同群体的非同义突变多样性πn皆小于同义突变多样性πs。LD分析显示,当r20.1时,在6个群体中LD衰退序列长度在1 025~2 460 bp间变化,在基因内部LD水平已衰退至不显著。【结论】杉木Cl NAC1基因可能参与次生壁的发育。Cl NAC1在不同无性系间存在丰富的SNP变异,且在进化中主要受纯化选择作用。不同杉木群体中Cl NAC1基因SNP位点间的LD皆在较短序列长度内迅速消失,表明基于候选基因的LD作图策略在杉木关联作图研究中是可行的。     

3种杉木种子活力测定方法比较

  目的  建立一种快速简便的杉木Cunninghamia laneolata种子活力测定方法。  方法  以3个不同品种杉木种子为材料，以标准发芽法为参照，比较四氮唑法(TTC)和紫外分光光度计法(UVS)测定种子活力时的准确性和便捷性。  结果  标准发芽法测定种子活力最为准确，但耗费时间长，难以开展大批量测定；TTC法测定杉木种子活力准确度不稳定，且操作繁琐；UVS法的测定值与真实萌发率比较接近，有较高可信度，且操作简便。  结论  UVS法可作为快速测定杉木种子活力的优选方法。图2表5参21     

早竹TB1同源基因的克隆和表达分析

竹笋的形成和生长发育过程涉及侧枝形态发生,探讨侧枝发育有关基因在竹笋发育过程中的作用,对于阐明竹笋发育基因调控机制有重要意义.利用禾本科TB1同源基因在序列上的保守性,在基因上游的非编码区设计简并引物,通过RT-PCR技术, 从早竹笋中克隆到一个1 296 bp的cDNA序列,该序列包含1个编码349个氨基酸的阅读框,在氨基酸水平上与玉米TB1相似性达64.7%,定名为PpTB1.序列分析比对表明,PpTB1基因的编码产物含有保守的SP区、TCP区和R区,属于基因家族的1个成员.进化分析进一步表明,竹子TB1相似基因是玉米TB1基因的同源基因,且竹子TB1同源基因的分歧时间介于水稻和现有其他TB1同源基因之间.RT-PCR分析表明,该基因在笋、叶片和花中均有表达.原位杂交分析表明,PpTB1在笋的侧芽中表达较多.研究表明,PpTB1很可能与禾本科其他植物的TB1同源基因相似,在竹笋发育过程中,参与侧枝的形成.另外,TB1同源基因也可能在竹子分类和进化研究上有重要价值.     

杉木纤维素合成酶基因CesA的克隆及表达分析

通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合c DNA末端快速扩增(RACE)技术,从杉木Cunninghamia lanceolata中克隆到2个全长为3 235 bp和3 876 bp的纤维素合成酶基因c DNA序列,被分别命名为Cl Ces A1和Cl Ces A2,Gen Bank登录号分别为JQ844574和JQ844575。相应编码蛋白分别包含992和1 092个氨基酸残基,推测分子量为111 845.3 D和123 105.7 D,等电点为6.04和6.65。氨基酸序列分析发现,它们具有植物纤维素合成酶基因相应的结构特征——锌指结构,2个易变区CSRI和CSRII,2个保守区CRI和CRII,纤维素合成酶底物结合结构域"D,D,D,QVLRW",以及8个跨膜区。荧光定量PCR分析表明:Cl Ces A1和Cl Ces A2基因在茎中表达丰度均为最高,且成熟木质部中表达量均高于皮层中的相应数值;2个基因在根和针叶中的表达量相对较低。以具特殊材质性状的矮生杉木和正常杉木木质部为材料的进一步表达分析发现:Cl Ces A1和Cl Ces A2在正常杉木木质部中的表达量大约是矮生杉木表达量的2~12倍。2个杉木Ces A基因可能在杉木木材形成过程中具有重要作用。     

枫香优良观赏种质的遗传多样性分析

利用ISSR标记技术对12份枫香观赏种质进行遗传多样性分析,通过正交实验优化枫香的ISSR-PCR扩增体系,即在20μL体系中加入PCR反应缓冲液2μL、镁离子1.5 mmol.L-1、Taq DNA聚合酶0.75 U、dNTP 0.15 mmol.L-1、引物0.4mmol.L-1、DNA模板80 ng。筛选出的19条ISSR引物共得到131条扩增带,其中多态性条带为94条,多态性条带比率为71.75%。12份种质的有效等位基因数是1.482,基因多样性0.3012,Shannon信息指数0.4674,表明遗传多样性水平相对较高。进一步的聚类将这些种质分成3类,其中4号样本和11号样本的遗传相似度最高。     

杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白（CSL）作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区。利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）结合cDNA末端快速扩增技术（RACE）成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列。应用美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因。多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71%以上。利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础。图5参10     

伯乐树ISSR分子标记体系的建立

从浙江省庆元县等地采集23份野生伯乐树单株叶片为试验材料,采用单因素对比试验和正交优化试验研究了模板DNA、Taq DNA聚合酶的用量,以及Mg~(2+)、dNTP、引物浓度和退火温度对PCR扩增的影响,建立伯乐树适宜的ISSR-PCR扩增体系,即20μL体系中含90ng模板DNA,1×PCR buffer,1.0mmol/L Mg~(2+),0.15mmol/LdNTP,0.5μmol/L引物,0.75U Taq DNA聚合酶,退火温度为50℃。     

云锦杜鹃转录组分析

云锦杜鹃Rhododendron fortunei具有很高的园艺观赏价值。由于缺乏相关的遗传信息,云锦杜鹃的多样性、分子辅助育种等工作进展较为缓慢。通过高通量测序技术（Illumina）,对云锦杜鹃的转录组进行了测定和分析。通过测序拼接和去冗余共获得84 633条单基因簇（unigene）序列,平均长度为691.4 bp。通过与公共数据库比对成功注释到了35 526条单基因簇,其中与葡萄Vitis vinifera基因相似的序列最多。根据基因本体论数据库（GO）可将23 215个单基因簇归类于生物学过程、细胞组分及分子功能等三大类的55个功能组;真核直系同源基因数据库（KOG）将11 085条单基因簇分为26个功能分类,涉及一般功能预测的单基因簇最多,多达1 970条;以京都基因与基金组百科全书（KEGG）作为参考,依据代谢途径可将9 887个单基因簇定位到272个代谢通路。进一步分析基因注释结果,挖掘获得24个编码MADS-box基因的单基因簇分属于10个不同亚家族。此外,检测到了21 900个简单序列重复（SSR）位点,可用于SSR标记开发。     

杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白(CSL)作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区.利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RTPCR)结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列.应用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因.多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71％以上.利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础.     

杉木应压木形成中的显微特征及主要代谢成分变化

为了解析主要代谢成分与杉木(Cunninghamia lanceolata)应压木形成的关系,以3年生直立杉木苗为研究对象,与垂直方向倾斜45°放置30、60和90 d后观察其生长性状并测定木质纤维素含量,使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对木质部代谢成分进行鉴定和解析。解剖发现应压木木质部管胞发生变形;化学成分测定发现总木质素和半纤维素含量增加,纤维素含量降低;GC-MS检测出应压木、对应木和直立木中共有成分20种,其中有机酸7种、单糖3种、二糖2种、醇类3种、氨基酸2种、酚类和糖苷类各1种;主成分分析结合显著性检验发现,3个时期应压木和直立木中有11种共有差异代谢物,其中乙醇酸、甘氨酸、核糖酸和棕榈酸在应压木中的含量显著低于对应木和直立木,苹果酸、松醇、肌醇、半乳糖和蔗糖在应压木中的含量显著高于对应木和直立木。本试验结果从代谢角度解释了杉木应压木形成中的生物学变化,可为揭示木材形成的分子机制提供新途径,并为高品质木材的定向培育和木材功能性改良提供理论依据。