光皮桦BlSPL1转录因子基因的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

Squamosa promoter binding protein like genes(SPLs)对植物开花具有重要的调控作用.基于转录组序列并利用RACE技术从光皮桦中分离获得BlSPL1基因,其cDNA序列全长1 825 bp,包含开放阅读框长1 170 bp,编码389个氨基酸,与桃PpSPL1(EMJ10405)的同源性最高(67％),属于陆地植物SPLs基因家族的group VⅧ分支.表达分析显示BlSPL1在光皮桦芽、雌花、雄花、幼苗中均有表达,在雄花和幼苗中表达量较低,但在芽发育成雌花过程中明显上调,推测其可能对早期的雌花形成起调控作用.同时,从57个不同的光皮桦无性系中克隆BlSPL1的基因组序列,进行单核苷酸多态性(SNP)分析,共检测到98个SNP位点,SNP频率为1/26 bp,多样性指数π为0.007 12.在外显子区域,共检测到28个SNP位点,其中11个为同义突变,17个为错义突变.进一步的连锁不平衡分析显示,随着序列长度的增加,不同光皮桦群体BlSPL1内的SNPs连锁不平衡在基因内部迅速衰退.     

毛白杨蔗糖合酶基因PtSUS1的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

利用RT-PCR方法,首次从毛白杨成熟木质部cDNA文库中分离出PtSUS1 cDNA全长,并进行了测序和序列分析。结果表明:克隆的毛白杨PtSUS1 cDNA片段总长为2703bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为2415bp,可编码长度为805个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥AtSUS1、水稻OsSUS1的蛋白质氨基酸序列同源性分别为83.4%,75.7%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtSUS1在成熟木质部表达丰度最高,在成熟叶片、根部和正在发育的木质部表达丰度中等,在韧皮部和形成层有少量表达,在嫩叶与顶端分生组织中表达丰度最低。在此基础上,组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.4软件对毛白杨40株基因型个体的PtSUS1序列进行比对和分析,共检测到235个单核苷酸多态性(SNP)位点,SNP频率为1/25bp,多样性指数π为0.00924。在外显子区域,共检测到66个SNP位点,其中55个为同义突变,10个为错义突变,1个为无义突变。在编码区内,非同义突变与同义突变的比率<1,这一结果显示在毛白杨物种演化过程中,纯化选择是PtSUS1基因内同义SNP位...     

杨树热激转录因子HsfAld的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

利用RT-PCR方法,首次由小叶杨受热激胁迫后构建的cDNA文库中扩增获得一热激转录因子HsfAldcDNA克隆,测序结果表明克隆的PsHsfAld cDNA片段总长为2 036 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为1 449 bp,可编码长度为482个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列在HSF DBD结构功能域与拟南芥AtHsfAld和水稻OsHsfAl蛋白的相似性分别为86.3%和87.4%.组织特异性Realtime-PCR结果显示,Ps HsfAld主要在杨树叶片和根部组织中高丰度表达.非生物胁迫、激素及糖诱导表达表明,PsHsfAld不仅受高温、干旱与盐诱导表达,还受到激素中GA3与ABA,及葡萄糖与蔗糖信号的上调表达.组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.7软件对小叶杨36株基因型个体的PsHsfAld序列进行比对和分析,共检测到207个单核苷酸多态性(SNP)位点,SNP频率为1/16 bp,多样性指数π为0.007 72.在编码区域,共检测到69个SNP位点,其中37个为同义突变,31个为错义突变,1个为无义突变;非同义突变与同义突变的比率0.132＜1,推测在小叶杨物种演化过程中,纯化选择是该基因内同义SNP位点主要的进化驱动力.     

杨树热激转录因子HsfA1d的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

利用RT-PCR方法,首次由小叶杨受热激胁迫后构建的cDNA文库中扩增获得一热激转录因子HsfA1d cDNA克隆,测序结果表明克隆的PsHsfA1d cDNA片段总长为2036bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为1449bp,可编码长度为482个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列在HSF DBD结构功能域与拟南芥AtHsfA1d和水稻OsHsfA1蛋白的相似性分别为86.3%和87.4%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PsHsfA1d主要在杨树叶片和根部组织中高丰度表达。非生物胁迫、激素及糖诱导表达表明,PsHsfA1d不仅受高温、干旱与盐诱导表达,还受到激素中GA_3与ABA,及葡萄糖与蔗糖信号的上调表达。组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.7软件对小叶杨36株基因型个体的PsHsfA1d序列进行比对和分析,共检测到207个单核苷酸多态性(SNP)位点,SNP频率为1/16bp,多样性指数π为0.00772。在编码区域,共检测到69个SNP位点,其中37个为同义突变,31个为错义突变,1个为无义突变;非同义突变与同义突变的比率0.132<1,推测在小叶杨物种演化过程...     

日本落叶松纤维素合酶基因片段的克隆及单核苷酸多态性分析

[目的]纤维素合酶(cellulose synthase,CesA)在植物纤维素合成途径中发挥主要调节作用,是控制木材纤维品质和产量的重要基因.从日本落叶松中分离克隆与纤维素合成相关的LkCesA基因,并对其进行核苷酸多样性以及连锁不平衡分析,为在日本落叶松中开展基于LkCesA基因的连锁不平衡作图及其辅助日本落叶松木材纤维性状的分子育种提供理论依据.[方法]依据日本落叶松转录组数据库检测到的纤维素合酶(CesA)基因ESTs序列设计引物,从日本落叶松中分离获得LkCesA基因片段.在此基础上,利用DnaSP5.0软件对日本落叶松40株基因型个体的LkCesA序列进行核苷酸多样性和连锁不平衡分析.[结果]从日本落叶松中成功克隆了CesA基因片段:该片段长1 209 bp,包含部分开放阅读框,长度为1 053 bp,可编码350个氨基酸,所推导的蛋白质氨基酸序列与火炬松Pt-CesA2的蛋白质氨基酸序列同源性为95.4％.在日本落叶松40株基因型个体的LkCesA序列中共检测到83个SNP位点,SNP发生频率为1/21 bp,多样性指数πT为0.006 05.在这些SNPs中,69个属于转换,14个属于颠换,其中19个为常见SNPs,64个为罕见SNPs.在外显子区域,共检测到54个SNP位点,其中34个为错义突变,20个为同义突变.进一步的连锁不平衡分析显示,随着核苷酸序列长度的增加,SNP连锁不平衡程度逐渐减弱.[结论]克隆到的LkCesA为植物CesA基因家族中的一员.LkCesA基因的连锁不平衡在基因内部就已衰退,说明选择该基因作为候选基因,在日本落叶松中开展连锁不平衡作图用于指导日本落叶松的定向培育及木材品质改良是可行的.此外,在LkCesA基因中检测到多个常见SNP位点,为进一步开展该基因的连锁不平衡作图提供了材料.     

日本落叶松咖啡酸-O-甲基转移酶基因 LkCOMT的克隆及单核苷酸多态性分析

依据日本落叶松转录组数据库检测到的咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)基因ESTs序列设计引物,分离得到一个编码该酶的新基因。其cDNA克隆全长为1 350 bp,包含长度为1 092 bp的开放阅读框,可编码364个氨基酸残基。序列分析显示,所推导的蛋白质氨基酸序列包含COMT基因5个所特有的保守元件,与海岸松PpCOMT的蛋白质氨基酸序列同源性达94%。在此基础上,利用DnaSP5.0软件对日本落叶松40株基因型个体的LkCOMT序列进行了单核苷酸多样性SNPs分析,共检测到92个SNP位点,SNP发生频率为1/17 bp,多样性指数π_T为0.007 80。在这些SNPs中,65个属于转换,27个属于颠换。在外显子区域,共检测到58个SNP位点,其中37个为错义突变,21个为同义突变。研究结果为日本落叶松基因标记辅助育种提供了理论基础。     

毛白杨纤维素合酶基因PtCesA_4的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

组合利用生物信息学和RT-PCR方法,首次从毛白杨未成熟木质部cDNA中分离出PtCesA4cDNA全长,并进行测序和序列分析,结果表明克隆的毛白杨PtCesA4 cDNA片段总长为3 757 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为3 129 bp,可编码长度为1 042个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥AtCesA4、水稻OsCesA,和火炬松PtCesA2的蛋白质氨基酸序列同源性分别为80.3%,78.9%和75.6%.组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtCesA4基因在杨树根、茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式却不同:PtCesA4在成熟叶片、未成熟木质部和成熟木质部中表达丰度最高,在根部和顶端分生组织表达丰度中等,在树皮和韧皮部有少量表达,在形成层中表达丰度最低.在此基础上,组合利用MEGA3.1和DnaSP4.50.4软件对毛白杨40株基因型个体的PtCesA4序列进行比对和分析,检测到153个单核苷酸多态性(sinsh nueleotide polymorphism,SNP)位点,SNP频率为1/35 bp,多样性指数π/0.005 02.其中51个是常见SNPs,102个为罕见SNPs.在这些SNPs中,有118个属于转换,35个属于颠换.在外显子区域,共检测到69个SNP位点,其中59个为同义突变,10个为错义突变.对PtCesA4基因内SNPs进行的连锁不平衡分析结果显示,随着核苷酸序列长度的增加,SNPs的连锁不平衡在基因内部迅速衰退,因此,在毛白杨中,基于PtCesA4基因的连锁不平衡作图是可行的,而基于整个杨树基因组的连锁不平衡作图是不可行的.也是不必要的.研究结果为毛白杨PtCesA4基因的连锁不平衡作图及其基因辅助毛白杨木材纤维性状的分子育种提供了理论依据.     

牛枝子抗旱候选基因LpDREB的克隆与表达及单核苷酸多态性分析

牛枝子为胡枝子属中最具耐旱特性的灌木树种,是研究基于单核苷酸多态性(SNP)水平的植物个体间耐旱差异机制的重要材料。以5个种源的天然牛枝子为材料,利用染色体步移技术克隆牛枝子抗旱候选基因LpDREB的全长序列,对LpDREB基因的结构和系统进化进行分析,研究LpDREB基因的组织及诱导表达规律,分析LpDREB基因的SNP分布和类型。研究结果表明:克隆的牛枝子LpDREB基因cDNA片段全长为1611bp,具有957bp的开放阅读框,编码318个氨基酸,包含DREB基因所特有的DREBP/AP2保守区域。LpDREB基因同大豆GmDREB3基因的进化关系最近,但2个基因除保守区域外的其他区域相似性不高。牛枝子LpDREB基因受干旱胁迫诱导表达,在组织器官中的根部表达量最大,其次为叶片,茎中的表达量最少。在天然牛枝子群体中共检测到23个SNP位点,其中启动子及5’端非编码区4个,编码区17个,3’端非编码区2个;23个SNP中,12个属于转换,11个属于颠换;编码区内的17个SNPs位点中,9个属于同义突变,8个为非同义突变,同义突变与非同义突变的比值为1.1。研究结果为基于SNP水平的牛枝子抗旱候选基因的关联分析奠定基础。     

毛白杨干细胞决定基因Wuschel的克隆及其单核苷酸多态性分析

Wuschel(Wus)转录因子基因在维持干细胞群数量上具有关键性的调控作用.以模式植物拟南芥Wus为信息探针,在杨树基因组中共检测到2个Wus候选基因,并设计了基因特异的引物,从毛白杨形成层cDNA中分离得到长度分别为922 bp和956 bp的2个cDNA,其分别含有编码258个和264个氨基酸残基的完整开放阅读框.所推导的蛋白质氨基酸序列在结构功能域区域分别与拟南芥Wus蛋白的同源性为76.O%和74.9%,故将其命名为PtWus1和PtWus2.在此基础上,组合利用MEGA3.1和DnaSP4.0软件对毛白杨36株基因型个体的PtWus1和PtWus2序列进行比对和分析,分别检测到58个和51个单核苷酸多态性(SNP)位点,多样性分别为1/27 bp和1/30 bp.对于PtWus1,共检测到24个常见SNPs和34个罕见SNPs,其中43个属于转换,15个属于颠换;在外显子区域,共检测到21个SNP位点,其中16个为同义突变,4个为错义突变,1个为无义突变.而对于PtWus2,基因内部含有28个常见SNPs和23个罕见SNP,其中36个属于转换,15个属于颠换;在编码区域检测到的26个SNPs中,同义突变和错义突变均为13个.对PtWus,和PtWus2基因内SNPs进行的连锁不平衡分析结果显示,随着核苷酸序列长度的增加,SNPs的连锁不平衡在基因内部迅速衰退,因此,在毛白杨中,基于候选基因的连锁不平衡作图是可行的,而基于整个杨树基因组的连锁不平衡作图是不可行的,也是不必要的.本研究为毛白杨Wus蛋白转录因子基因的连锁不平衡作图及其基因辅助毛白杨木材纤维性状的分子育种提供了理论依据.     

小叶杨GA20氧化酶基因的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

利用RT-PCR方法,首次从小叶杨未成熟木质部cDNA中分离出PsGA20Ox cDNA全长及其基因组DNA,并进行测序和序列分析.结果表明:克隆的小叶杨PsGA20Ox cDNA片段总长为1 403 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为1 155 bp,编码区可编码长度为385个从残基,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥和水稻GA20Ox蛋白的同源性分别为66.0%和57.0%.组织特异性RT-PCR结果显示,PsGA20Ox基因在杨树茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式却不同:PsGA20Ox在成熟木质部中表达丰度最高,在未成熟木质部和嫩叶中表达丰度较高,在顶端分生组织中有少量表达,在形成层组织中表达丰度极低.在此基础上,组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.4软件对小叶杨36株基因型个体的PsGA20Ox基因组DNA序列进行比对和分析,检测到49个单核苷酸多态性(SNP)位点,频率为1/35 bp.其中,15个是常见SNPs,34个为罕见SNPs.在这些SNPs中,37个属于转换,12个属于颠换.在外显子区域,共检测到26个SNP位点,其中23个为同义突变,3个为错义突变.对PsGA20Ox基因内SNPs进行的连锁不平衡分析表明,随着核苷酸序列长度的增加,SNPs的连锁不平衡在基因内部就迅速衰退,因此,在小叶杨中,基于候选基因的连锁不平衡作图是可行的,而基于整个杨树基因组的连锁不平衡作图是不可行的,也是不必要的.     

基于转录组测序的陈山红心杉EST-SSR开发及应用

【目的】目前杉木分子标记数量无法满足种质资源评价及分子标记辅助育种等相关研究需求,需要开发更多的杉木SSR标记十分重要。【方法】以陈山红心杉转录组测序数据为基础,进行EST-SSR标记的检测和开发,并对陈山红心杉二代种子园进行遗传变异分析。【结果】转录组测序共获得99 122 394个reads片段,包含了14.87 Gb的序列数据。序列组装后,获得76 597个unigene,共计104.18 Mb数据,平均长983 bp。寻找到8 072个SSR位点,单核苷酸和三核苷酸是主要重复类型,分别占总数的66.30%和17.48%,其次是二核苷酸重复类型,占总数的12.31%。AT/TA和AG/TC是主要的双碱基重复序列,分别占总位点数的6.79%和1.93%。AGA/TCT和AAG/TTC是主要的三碱基重复序列,分别占总位点数的1.45%和1.44%。从随机挑选的150对SSR引物中筛选出11对多态性引物。陈山红心杉二代种子园SSR位点间的平均等位基因数为4.4个,有效等位基因为2.4个;群体平均观察杂合度、期望杂合度、Shannon多样性指数分别为0.533 5、0.563 8、1.003 4,表明该种子园遗传多样性较高。陈山红心杉二代种子园无性系间的遗传相似系数在0.240 0～0.977 8之间,平均值为0.589 3,说明这一群体有较宽的遗传基础。在阈值0.62处可将无性系划分为6个亚群体,亚群体内个体数量差异较大。【结论】本研究基于陈山红心杉转录组数据开发出11对EST-SSR标记,丰富了杉木分子标记库,这些标记可用于杉木种质资源评价、遗传多样性分析及分子标记辅助育种等方面。     

黄藤2个NAC基因的分子特征及其SSR分子标记开发

【目的】棕榈藤是重要的森林植物,纤鞭是其重要的攀援器官,也是重要的分类依据。研究黄藤NAC(NAM,ATAF和CUC)转录因子基因的分子特征并开发SSR分子标记,以期为棕榈藤的分子育种和辅助分类提供参考依据。【方法】以黄藤为材料,借助转录组数据,采用同源克隆的方法从黄藤中分离NAC基因,采用生物信息学方法进行基因结构、蛋白性质与结构分析和SSR位点预测,采用实时定量PCR技术分析基因的组织表达特性,利用PAGE电泳和测序技术分析SSR分子标记在不同棕榈藤样品中的通用性和多态性。【结果】从黄藤叶片中获得了2个NAC同源基因DjNAC3(Gen Bank登录号:KU556738)和DjNAC4(Gen Bank登录号:KX579750),二者的开放阅读框长度分别为729 bp和1 326 bp,对应的基因组序列为850 bp和1 441 bp,均包含2个外显子和1个内含子。DjNAC3和DjNAC4编码的蛋白分别为242 aa和441 aa。蛋白结构分析表明,DjNAC3和DjNAC4具有典型的NAC转录因子结构特征,属于NAC家族的CUC亚家族,但二者之间的相似系数仅为23.6%,表明它们在黄藤生长发育过程中可能具有不同的功能。DjNAC3和DjNAC4在不同组织中的表达模式存在明显差异,DjNAC3在发育成熟纤鞭中的表达丰度最高,叶片中的表达丰度最低,而DjNAC4则在发育成熟的钩刺中表达丰度最高,而发育初期的钩刺中最低。在DjNAC3和DjNAC4的基因组序列中分别包含1个SSR位点,其中前者的SSR位点位于内含子区域,为(TA)6,后者的SSR位点位于第1个外显子区域,为(GCA)5。根据DjNAC3和DjNAC4中SSR位点旁侧序列设计引物,以黄藤和另外20个不同棕榈藤样品的基因组DNA为模板进行扩增,PAGE电泳结果分析表明,引物具有较高的通用性,且扩增产物具有多态性。6个样品的测序结果证实,用DjNAC3设计引物的扩增产物测序获得的SSR位点序列存在着一定的差异,既包括SSR类型变异、重复次数变化等多态性,又有SSR位点缺失的现象;而根据DjNAC4设计引物扩增获得的SSR位点序列差异主要为重复次数的变化。【结论】黄藤DjNAC3和DjNAC4基因的基因结构、表达模式、SSR位点等均存在明显的差异,这表明它们在黄藤生长发育中可能具有不同的功能,二者所包含的SSR分子标记具有通用性和多态性,可以作为分子标记应用于棕榈藤的辅助分类和分子辅助育种。     

杉木磷转运蛋白基因ClPht1;1的克隆及表达分析

【目的】PHT1基因家族是影响植物吸收磷营养的重要磷转运子之一。从杉木32号磷高效家系c DNA中克隆得到PHT1基因家族的1个杉木磷转运蛋白基因ClPht1;1,并对不同程度磷胁迫下ClPht1;1的时空表达进行研究,为杉木PHT1基因序列特征和功能结构的研究以及磷高效利用杉木基因型的选育奠定基础。【方法】根据PHT1基因家族序列保守性设计简并引物,以32号磷高效杉木基因型根系c DNA为模板进行扩增获得目的基因ClPht1;1的c DNA序列,使用RACE技术对目的基因进行全长克隆,并对其序列特征、同源性和编码磷转运蛋白结构进行分析。实时荧光定量PCR检测ClPht1;1在32号磷高效杉木家系根、茎、叶中的表达,检测中度缺磷胁迫下ClPht1;1在不同磷利用效率杉木4号、15号、25号、27号、28号、32号家系根系中的表达差异,以及在中度、重度缺磷胁迫下ClPht1;1在32号磷高效杉木家系根系中随时间序列的表达量变化。【结果】克隆得到1个杉木磷转运蛋白PHT1基因,命名为ClPht1;1(Gen Bank登录号:KX302006),基因序列编码区长1 638 bp,编码545 aa的蛋白质。ClPht1;1所编码蛋白质由12个疏水的跨膜区域组成,1个疑似跨膜域。每个跨膜结构域基本由17~25个氨基酸残基组成螺旋,同时跨膜蛋白的N端和C端均位于细胞质内,保守序列位于第4个跨膜域。构成蛋白质的主要骨架是α-螺旋,无信号肽序列。ClPht1;1基因编码蛋白与日本柳杉PHT基因编码蛋白的氨基酸序列相似性达到87.0%,与胡杨、油茶、马尾松等PHT家族基因编码蛋白的氨基酸序列相似性均在75%以上。ClPht1;1基因在杉木的根、茎、叶组织中均有表达,其中在根中的表达量最高,在叶中的表达量最低。在中度缺磷胁迫下,ClPht1;1基因在杉木不同家系根部的表达量为25号27号4号15号32号28号。在中度和重度缺磷胁迫下,ClPht1;1基因在32号杉木家系根部的表达量随胁迫时间的延长而逐渐上升;恢复供磷后,ClPht1;1基因表达量逐渐下降至正常水平;重度缺磷胁迫下,ClPht1;1基因表达量要高于其在中度缺磷胁迫下的表达量。【结论】ClPht1;1基因具有PHT1基因家族的典型结构,其编码蛋白的氨基酸序列与日本柳杉等磷转运蛋白氨基酸序列具有高度相似性,为杉木高亲和磷转运蛋白PHT1基因家族成员。ClPht1;1基因主要在杉木的根部表达,在叶片中的表达量较低;杉木磷利用效率越强,ClPht1;1基因在其根部的表达量越高。在不同磷利用效率的杉木家系中ClPht1;1基因表达量存在较大差异。ClPht1;1基因的表达受低磷胁迫的诱导,缺磷胁迫下ClPht1;1基因表达量明显升高,恢复供磷后ClPht1;1基因表达量明显降低。     

毛竹PeSCR基因的表达与功能

【目的】SCARECROW(SCR)基因在植物根和茎顶端细胞不均等分裂形成基本组织的过程中发挥着重要调控作用。通过分析毛竹中SCR同源基因Pe SCR的结构特点,研究该基因的组织表达特异性,分析激素GA3、ABA以及干旱、Na Cl等非生物胁迫处理对该基因的表达影响,利用在拟南芥中过量表达Pe SCR,初步鉴定其功能,以期为竹子分子育种提供基因资源。【方法】采用生物信息学的方法,在毛竹数据库(Bamboo GDB)中获得SCR同源基因序列和上游调控序列,分别利用Spidey和Plant CARE在线软件分析基因结构特点及其上游调控序列所含作用元件,采用实时荧光定量PCR技术分析基因在不同组织中的表达性,以及GA3、ABA、干旱和Na Cl等非生物胁迫处理后的表达变化,构建Pe SCR基因的正义/反义表达载体,转化拟南芥,通过分析转基因植株的表型来判断基因的功能。【结果】从毛竹中获得SCR同源基因Pe SCR(登录号:FP094510),c DNA全长为2 301 bp,其中5'和3'端非编码区分别为238,134 bp,编码区1 929 bp。编码区对应的基因组序列为2 598 bp,包含1个内含子(672 bp)。Pe SCR编码1个642个氨基酸的蛋白,该蛋白具有GRAS家族的典型结构域(LRⅠ,VHIID,LRⅡ,PFYRE和SAW),属于At SCR亚家族。Pe SCR蛋白与其他植物SCR有很高的同源性,其中与水稻的Os SCR2和拟南芥的At SCR的一致性分别为84.9%,54.9%。Pe SCR上游调控序列为1 820 bp,包含生长素应答元件AuxRR-core、ABA应答元件MotifⅡb、干旱诱导MYB结合位点MBS、光应答元件等多种作用元件,这意味着Pe SCR可能受到激素、干旱等的调控。q PCR结果表明,Pe SCR在叶中的表达丰度最高,其次是根和茎,而鞘中最低;Pe SCR的表达短时间内受GA3的抑制,随处理时间延长(至5 h),基因的表达受到诱导;Pe SCR的表达总体受外源ABA和Na Cl处理的抑制;干旱处理条件下Pe SCR基因表达呈先上升后下降的趋势。RT-PCR证明Pe SCR已在转基因拟南芥植株中得到表达,表型分析发现,与野生型相比转正义基因植株生长健壮,根系发达,而反义植株矮小,根系生长受到抑制。【结论】在毛竹各组织中Pe SCR呈组成型表达,根中表达受到GA3、ABA以及干旱、Na Cl的影响。该基因正义表达促进转基因植株生长,反义转基因植株则受到抑制,表明该基因可能参与毛竹的生长发育调控。     

紫花苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因同源克隆与序列变异分析

β-1,3-葡聚糖酶是植物重要的防卫蛋白之一。采用同源克隆法,从16个紫花苜蓿品种的集群DNA中分离到3个苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因的部分基因组编码序列,分别对应于蒺藜苜蓿3个不同的β-1,3-葡聚糖酶基因,并命名为β-1,3-葡聚糖酶基因1、β-1,3-葡聚糖酶基因2和β-1,3-葡聚糖酶基因3。其中,β-1,3-葡聚糖酶基因2和苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因3及其蒺藜苜蓿对应基因与包括β-1,3-葡聚糖酶基因1在内的其他豆科同类基因遗传距离较大。序列变异分析显示,β-1,3-葡聚糖酶基因2的SNP位点间平均距离为255bp,DNA和氨基酸序列均非常保守,表明其在进化中受到了强烈的选择压力。β-1,3-葡聚糖酶基因1的SNP位点间平均距离虽然较小(31bp),但其全部21个SNP位点均为同义SNP,同时,测序片段仅发现了10个单倍型,远远小于其理论单倍型数目(2~(21))。这表明β-1,3-葡聚糖酶基因1的氨基酸序列高度保守,在功能上非常重要,少量单倍型的存在是为了调节其表达,以使苜蓿适应多种内、外部环境条件。     

欧洲黑杨PnEXPA1基因多态性与稳定碳同位素比率的关联分析

对欧洲黑杨α-expansin基因PnEXPA1的SNP多态性与水分利用效率相关性状稳定碳同位素比率(δ13C)进行了关联分析。利用SNaPshot技术对PnEXPA1基因内11个SNP位点进行了基因型分型,发现各SNP位点优势基因型均为纯合,且其频率高于杂合基因型。关联分析显示:SNP8和SNP12在采用单因素方差分析(ANOVA)和一般线性模型(GLM)2种方法时均与δ13C值显著关联。SNP8为exon 1内的无义突变,可解释6.620%的表型变异;而SNP12位于intron 1中,遗传贡献率为6.613%;这2个SNP位点与SNP9、SNP13共同位于一个高连锁不平衡(LD)的单倍型块中。SNP8与SNP12的TT基因型无性系均具有较高的δ13C值,为优势基因型。     

毛白杨PtDREB2A基因的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

利用基因特异的PCR引物由毛白杨受干旱胁迫后构建的cDNA文库中扩增获得一PtDREB2A cDNA克隆,并进行测序和序列分析,结果表明:PtDREB2A cDNA片段总长为946 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为864 bp,可编码长度为287个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列在AP2/ERF结构功能域与拟南芥AtDREB2A和水稻OsDREB2A蛋白的同源性分别为80.3%和83.3%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtDREB2A在杨树根、茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式不同:PtDREB2A在叶片表达丰度最高,在树干皮层及根部组织表达丰度中等,而在顶端分生组织及主干韧皮部、形成层与木质部表达丰度最低。非生物胁迫及激素诱导差异表达显示,PtDREB2A不仅受高温、低温、干旱与盐诱导表达,还受到激素IAA,NAA及GA3的上调表达,但与ABA的诱导无关。组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.4软件对毛白杨45株基因型个体的PtDREB2A序列进行比对和分析,共检测到49个单核苷酸多态性(SNP)位点,SNP频率为1/18 bp,多样性指数π为0.0...     

基于叶绿体18S、CP12、CP15序列的西藏巨柏群体多态性遗传评价

为分析西藏巨柏群体的遗传多样性,利用3个叶绿体基因(18S、CP12、CP15)针对8个群体的67份巨柏材料的叶绿体序列进行了测序分析。结果表明:3个序列的长度分别为300 bp、396 bp、1 000 bp,共检测出单倍型(H_1-H_11) 11个,多态性位点4个,简约性信息位点4个。表明巨柏整体遗传多样性的水平较高。同时根据AMOVA分析,发现群体内的变异也较大(85. 8%),因此针对巨柏宜采用就地保护措施。本研究对巨柏遗传资源的保护与有效利用具有重要的理论意义。     

基于cpDNA rps16序列分析兰考泡桐与白花泡桐和毛泡桐的遗传关系

【目的】通过测序法分析兰考泡桐与白花泡桐和毛泡桐在叶绿体rps16序列上的遗传差异,旨在分析三者之间在叶绿体基因上的变化特点和规律,探讨其种间的遗传关系。【方法】选取兰考泡桐、白花泡桐和毛泡桐各15个样本,对其提取的DNA用PCR扩增获得特异片段,并将其纯化与测序。利用软件Clustal X 2.0对所得序列进行排序;运行MEGA 4软件,进行多序列比对,分析其序列特征,并计算出K2P遗传距离。【结果】(1)对获得的rps16序列进行测定分析,得兰考泡桐序列长度分别为932 933 bp;白花泡桐序列长度为932 bp;毛泡桐序列长度分别为916918 bp。对所得rps16序列进行排序后的长度为938 bp,平均GC含量为34.31%。3个种所代表的个体之间共有10个变异位点,占整个序列长度的1.07%。其中有9个变异位点属于碱基插入或缺失类型,占变异位点总数的90%,占整个序列长度的0.96%。有1个变异位点属于碱基替换类型,占整个变异位点总数的10%,占整个序列长度的0.11%。(2)整个rps16片段的序列共有10个变异位点,其中兰考泡桐与白花泡桐在总的变异位点上,具有一致的碱基位点9个,占总变异的90%。而兰考泡桐与毛泡桐相比,没有相同的碱基。【结论】根据三种泡桐的rps16序列的序列特征和变异位点的分析,表明在叶绿体遗传方面,兰考泡桐具有与白花泡桐更多相似的遗传物质,其亲缘关系较近。综上所述,推测兰考泡桐与白花泡桐可能来自同一母系遗传。     

刚毛柽柳NAC24基因的表达及抗逆功能分析

【目的】NAC类转录因子是植物特有的最大的转录因子家族之一,广泛参与植物的生长发育过程,并在植物响应盐、干旱等多种非生物胁迫的过程中发挥至关重要的调控作用。本研究拟从盐生木本植物刚毛柽柳中克隆获得一个NAC转录因子基因,研究该基因的耐盐、抗旱功能,以期为研究木本植物NAC转录因子的抗逆分子机制奠定理论基础。【方法】在刚毛柽柳NaHCO_3胁迫转录组数据库中筛选获得一个NAC转录因子基因,将其命名为ThNAC24(GenBank登陆号:KF031949)。利用生物信息学工具将其与其他9个物种的NAC蛋白进行多序列比对,与拟南芥105个NAC蛋白进行进化树分析。分别用300 mmol·L^-1 NaCl和400 mmol·L^-1甘露醇对刚毛柽柳进行胁迫,在胁迫6、12、24和48 h后分别取刚毛柽柳根及叶组织。通过实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)技术分析盐、干旱胁迫下ThNAC24基因在不同胁迫时间点及不同组织的表达情况,初步鉴定其是否响应盐、干旱胁迫。为进一步研究ThNAC24基因的抗逆功能,分别构建植物过表达(pROKⅡ-ThNAC24)及抑制表达(pFGC5941-ThNAC24)载体。利用农杆菌介导的高效瞬时遗传转化体系获得ThNAC24基因瞬时过表达(OE)、抑制表达(IE)及对照(Control)刚毛柽柳植株。在盐、干旱胁迫下分析比较了ThNAC24基因瞬时过表达、抑制表达及对照刚毛柽柳植株的二氨基联苯胺(DAB)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色情况,过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,及电解质渗透率、失水率及丙二醛(MDA)含量,鉴定ThNAC24基因的耐盐、抗旱功能。【结果】ThNAC24基因的开放阅读框为1 023 bp,编码340个氨基酸。多序列比对结果显示ThNAC24在N端的氨基酸序列相似度比较高,具有NAC家族的序列特征;系统进化树分析结果显示ThNAC24与ANAC103和ANAC082的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示:盐胁迫下,ThNAC24基因上调表达,在根组织中胁迫12 h表达量最高,而叶组织中胁迫24 h的表达量最高;干旱胁迫下,ThNAC24基因上调表达,在根组织中胁迫6 h表达量最高,在叶组织中胁迫12 h的表达量最高。ThNAC24基因在刚毛柽柳根和叶组织中均有表达且响应盐和干旱胁迫。过表达ThNAC24基因显著降低了刚毛柽柳H_2O_2和超氧阴离子含量,增强了POD和SOD酶的活性,从而减少活性氧(ROS)的积累。过表达ThNAC24基因能够降低刚毛柽柳在逆境胁迫下的电解质渗透率、失水率及MDA的积累,从而保护细胞膜结构的完整性。【结论】刚毛柽柳ThNAC24基因能够响应盐、干旱胁迫,过表达ThNAC24基因植株通过增强POD和SOD活性,进而提高ROS清除能力,减少细胞受损或死亡,从而提高刚毛柽柳的耐盐及抗旱能力。