马占相思AmCesA2基因的克隆与表达分析

纤维素合酶在植物纤维素合成途径中发挥主要作用,是控制木材纤维品质和产量的决定因素。本试验以相思属的马占相思幼苗为材料,运用RACE技术,从中获得了一个Ces A基因,命名为AmCesA2。序列分析表明,AmCesA2的c DNA大小为3 643 bp,开放读码框为3 228 bp,推测编码1 075个氨基酸,该氨基酸具有纤维素合酶保守的D,D,D,QxxRW结构域以及植物纤维素合酶所特有的P-CR区及HVR区和N端的锌指结构。此外,AmCesA2的N端具有2个典型的跨膜结构,C端存在6个跨膜区域。聚类分析表明,AmCesA2与银合欢Ll Ces A7相似性最高。荧光定量PCR表明,AmCesA2在马占相思幼苗的茎中表达量最高,在根和叶中也有一定量的表达。用GA3,6-BA,BR这3种激素处理相思树幼苗,均可提高AmCesA2的表达量,且AmCesA2对GA3的响应最为强烈。     

亚麻LusiCesA1上调基因表达研究

研究通过克隆亚麻纤维素合成酶Lusi Ces A1基因,利用抑制差减杂交(SSH)技术,以DIANE Lusi Ces A1基因敲除RNA为Tester,常规RNA为Driver,构建亚麻纤维素合成酶c DNA文库,逆向斑点杂交验证阳性克隆,筛选差异表达克隆,鉴定出Lusi Ces A1上调表达增强基因122个,其中95个与已知功能基因同源,其余27个未知同源序列推断为亚麻纤维素合成途径新基因。Lusi Ces A1是亚麻纤维素合成途径关键酶基因,通过其上调表达作用机理分析,挖掘纤维合成过程上调表达基因,可改良亚麻品种。     

亚麻纤维素合酶LuCesA8基因克隆与表达分析

以亚麻快速生长期茎部组织总RNA为模板,通过反转录PCR克隆纤维素合酶基因Lu Ce s A8(基因ID:Lus10029245)全长开放读码框序列。序列分析结果表明,开放读码框全长2 967 bp,共编码988个氨基酸。通过多氨基酸序列比对发现,该蛋白与麻风树Ces A8蛋白亲缘关系最近,相似度达87%,与胡杨、可可树、雷蒙德氏棉及芝麻Ces A8蛋白氨基酸序列相似性分别为86%、85%、85%、81%。荧光定量PCR结果表明,该基因在亚麻不同发育阶段表达水平存在显著差异,快速生长期表达量最高,花期和绿熟期次之,苗期最低。研究为揭示Lu Ce s A8基因在次生细胞壁纤维素合成中的作用奠定基础。     

鹅Apo A1,CD36和DGAT2基因的cDNA克隆与序列分析

利用RACE技术,克隆获得了鹅Apolipoprotein A-1(Apo A1),Fatty acid translocase(CD36)和Diacylglycerol O-acyltransferase 2(DGAT2)基因的c DNA序列,包括全长的编码区序列(coding sequence,CDS)。结果表明,获得的鹅Apo A1基因的c DNA序列长度为1 106 bp(Gen Bank accession:KF460562),包括135 bp的5’UTR(untranslated region,UTR)序列,795 bp编码区和176 bp的3’UTR序列,编码265个氨基酸。获得的鹅CD36基因的c DNA序列长度为2 262 bp(Gen Bank accession:KF460563),包括196 bp的5’UTR序列,1 416bp编码区和650 bp的3’UTR序列,编码472个氨基酸。获得的鹅DGAT2基因的c DNA序列长度为1 341 bp(Gen Bank accession:KF460564),包括93 bp的5’UTR序列,1 077 bp编码区和171 bp的3’UTR序列,编码359个氨基酸。同源性分析结果表明,鹅这3个基因c DNA与鸭的同源性最高,达到90%以上,与人等哺乳动物的同源性均较低。     

雷竹纤维素合成酶基因cDNA克隆与表达分析

根据绿竹纤维素合成酶(cellulose synthase)基因的保守区序列设计引物,以雷竹cDNA为模板,采用PCR方法,成功扩增出1个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为3 385 bp,共编码1 056个氨基酸,将其命名为PpCesA1基因.氨基酸序列的分析结果表明,PpCesA1与其他纤维PeCesA4素合成酶有较高的同源性,同绿竹序列相似性高达94% ,且其序列具有典型的Cellulose_synt-GT-A 结构域,推测此PpCesA1为雷竹纤维素合成酶基因.对雷竹不同组织采用半定量方法研究该基因的表达情况,结果表明该基因在不同组织中的表达有明显差异.     

甘蓝纤维素合成酶基因BoCesA的克隆与序列分析

为研究甘蓝纤维素合成酶BoCesA基因在干旱胁迫下的表达模式,通过同源克隆得到甘蓝纤维素合成酶基因的cDNA全长,利用生物信息学软件分析该基因的特征;构建含BoCesA和GFP的融合表达载体,通过基因枪转化洋葱表皮细胞试验对该基因进行亚细胞定位;利用荧光定量PCR分析基因在不同组织中的表达情况及干旱胁迫下的表达模式。甘蓝纤维素合成酶BoCesA基因的cDNA全长为2 721bp,编码906个氨基酸,在N端含有锌指结构域和2个跨膜区,C端含有6个跨膜区,除包含植物纤维素合成酶基因共有的保守区外,还包含2个高突变区。通过氨基酸序列比对分析,发现甘蓝的该基因与拟南芥的AtCesA3基因同源性较高。亚细胞定位表明BoCesA基因初步定位于细胞质膜上。荧光定量PCR分析表明该基因在叶中的表达量高于茎和根中的表达量,在NaCl、PEG处理下BoCesA表达量呈现先升高后下降的趋势。通过对甘蓝纤维素合成酶BoCesA基因在NaCl、PEG胁迫下的表达分析,预测该基因对干旱胁迫有响应,它的表达受干旱胁迫的影响,这为进一步研究基因功能奠定了基础。     

芥蓝查尔酮合成酶基因BaCHS的克隆与序列分析

查尔酮合成酶基因是类黄酮生物合成途径的关键基因,在植物发育和逆境反应中起着重要作用.根据已发表的查尔酮合成酶基因序列设计全长引物,以芥蓝(Brassica albograbra)叶片基因组DNA和花蕾cDNA为模板,克隆到了芥蓝查尔酮合成酶基因全长序列,命名为BaCHS.该基因DNA全长为1 263 bp,具一个长度为75 bp的内含子,编码区长度为1 188 bp,编码395个氨基酸.序列比对结果表明,BaCHS基因编码的氨基酸序列与其他十字花科植物之间的同源性很高,仅存在个别氨基酸残基的差别.     

红麻查尔酮合成酶及其异构酶基因的克隆与表达分析

[目的]克隆红麻查尔酮合成酶(CHS)及其异构酶(CHI)基因并构建CH基因的植物表达载体,为进一步研究其在红麻育性及抗逆性中的作用奠定基础.[方法]提取红麻不育系(P3A)、保持系(P3B)花药RNA和DNA,以红麻花药转录组高通量测序数据为基础,利用同源克隆技术获得CHS和CHI基因,并利用载体重组技术构建CHS基因植物表达载体.[结果]红麻CHS基因cDNA全长序列为1236 bp,包含一个1170bp开放阅读框,编码389个氨基酸;其DNA序列全长为1329bp,包含2个外显子和1个内含子.CHI基因cDNA序列为724 bp,最大开放阅读框为630bp,编码209个氨基酸;其DNA序列全长为1087 bp,包含4个外显子和3个内含子.[结论]成功克隆获得红麻CHS和CHI基因的序列,构建的CHS基因植物表达载体pBI121-CHS可用于该基因功能的研究.     

杉木木糖合成酶基因ClUAXS2的全长克隆与分析

木糖合成酶UAXS基因是植物体内调控细胞壁中UDP-D-葡萄糖醛酸脱羧反应生成UDP-D-木糖/芹菜糖的关键性核苷糖合成酶,对植物细胞壁多糖物质的稳定合成和转换有重要意义。从杉木转录组中挑选获得木糖合成酶基因UAXS的中间序列,使用全长克隆技术和PCR技术克隆得到1个杉木木糖合成酶基因ClUAXS2。结果表明,ClUAXS2基因全长为1 753bp,包含的1 158bp的开放阅读框,可编码长度为386个氨基酸残基的蛋白质,其蛋白质分子式为C1936H3026N524O578S19,分子质量为43.90ku,等电位点为5.60。ClUAXS2基因为亲水性蛋白,没有信号肽结构域,编码1个疑似跨膜区域。蛋白质二级结构分析表明其蛋白主要骨架为Loop环和α-螺旋,预测亚细胞定位于细胞质中。通过对比分析发现ClUAXS2基因属于UAXS家族基因,编码1个UDP-D-Apiose/UDP-D-Xylose synthase 2(UAXS2)木糖酶蛋白。进化树分析结果显示,杉木ClUAXS2基因与无油樟(AtUAXS2)和可可树(TcUAXS2)的氨基酸序列相似度达到85%、86%,与拟南芥(AtAXS2),葡萄(VvUAXS)、毛果杨(PtAXS1)的氨基酸序列相似度为84%。实时荧光定量PCR结果表明,ClUAXS2基因在杉木的根、茎、叶中均有表达,但在1年生杉木幼苗茎中的表达量最高;ClUAXS2基因在不同杉木无性系茎中的表达量差异不显著,在根和叶中的表达量存在差异。     

偏肿革裥菌系统发育与Lg-mnp2和Lg-mnp3基因克隆及结构特征

白腐菌偏肿革裥菌Lenzites gibbosa能分泌降解木质素的锰过氧化物酶(MnPs),为进一步鉴定试验菌株,对菌株L. gibbosa CB1进行了ITS序列(Gen Bank登录号为JF279440)扩增与测序,并进行了基于ITS序列的比对与系统发育分析,结果表明CB1与桦革裥菌L. betulina和栓菌属Trametes等相关白腐菌的亲缘关系较近而聚类在一起,并与24个同种其他菌株的ITS序列覆盖度在85%～97%期间内的相似性都为99%,说明该菌株为偏肿革裥菌。为了获得该菌株多个编码MnP家族的基因,从而为研究MnP基因的表达调控奠定序列结构的基础,根据已知白腐菌MnPs基因保守区和已经扩增出的基因片段设计引物,以L. gibbosa CB1的基因组DNA和总RNA为模板,采用PCR、RT-PCR、RACE及染色体步移等方法,克隆到该菌株编码MnP2和MnP3的全长c DNA和DNA基因(Gen Bank登录号分别为JQ388597、JN571114; JQ411249、JN571116),分别命名为Lg-mnp2和Lg-mnp3。2个基因DNA全长分别为2 869、3 992 bp,都含有6个外显子和5个内含子;其启动子区域都含有TATA-Box、CAAT-Box、AP2、MRE等顺式作用元件,Lg-mnp2还含有AP1,Lg-mnp3还含有HSE;其c DNA基因分别含有50、52 bp的5'UTR,150、249 bp的3'UTR和1098、1 101 bp的完整开放阅读框ORF,分别编码了365、366个氨基酸的蛋白质多肽前体(Gen Bank登录号分别为AFC37493、AFC37494),成熟的Lg-mnp2蛋白含有339个氨基酸,比Lg-MnP1蛋白(Gen Bank登录号为ACO92620)多1个氨基酸;成熟的Lg-mnp3蛋白含有340个氨基酸,比Lg-MnP2蛋白多1个氨基酸。     

葡萄中白藜芦醇合成酶基因的克隆及其转化黄芪研究

利用RT-PCR技术从巨峰葡萄中克隆获得RS基因的全长c DNA序列,并利用农杆菌侵染法转化黄芪。试验结果表明:经Vector NTI 11.0软件分析克隆获得的RS基因全长序列长度为1 241 bp,并带14 bp长度的poly(A)尾巴,包含930 bp的开放读码框(ORF),编码1个含310个氨基酸残基的蛋白质。生物信息学分析结果表明:RS基因编码白藜芦醇合成酶,对RS基因全长序列进行蛋白质结构域分析,证明该基因具有查尔酮合成酶N端保守结构域,其长度为225个氨基酸。对黄芪进行遗传转化结果表明:获得了3棵黄芪转基因阳性植株,通过DNA、RNA以及蛋白质水平证明RS基因已经完全整合到黄芪基因组中并表达。     

苹果梨果实CHI基因cDNA克隆及表达分析

以苹果梨果实为试验材料,克隆得到CHI基因c DNA序列(片段),Gen Bank登录号:JN120854,其长度为444 bp,推断其编码148个氨基酸序列。生物信息学分析结果表明,该氨基酸序列与其他植物CHI氨基酸序列的同源性在90%左右,与砂梨CHI氨基酸序列聚类关系最近,该CHI基因c DNA序列含有常用的限制性内切酶Bam HI的识别位点。半定量RT-PCR分析结果表明,随着果实的成熟,套袋果与未套袋果CHI基因的表达量都不断增加,但套袋果在果实成熟期的表达量明显高于未套袋果。     

杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白(CSL)作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区.利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RTPCR)结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列.应用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因.多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71％以上.利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础.     

亚麻纤维素合酶超基因家族的生物信息学及表达分析

【目的】全基因组水平鉴定亚麻纤维素合酶超家族基因Ces A/Csls,并对基因的进化、基因结构及组织表达特性等进行分析,为亚麻纤维发育的机理研究奠定基础。【方法】利用Phytozome基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定亚麻纤维素合酶超基因家族成员,并进行蛋白理化特性分析;利用MEGA 5.0、GSDS、MEME等软件构建系统进化树,并进行基因结构、蛋白保守基序分析;根据RNA-Seq数据对Ces A/Csls进行表达分析。【结果】系统分析鉴定了45个亚麻Ces A/Csls超家族基因,该家族基因在scaffolds上是分散分布的,没有明显的成簇现象。Ces A/Csls蛋白主要分布于质膜上,氨基酸数目为409—1 167,分子量为47 401.1—130 578.3,等电点分布在5.43—9.08。Ces A/Csl蛋白均含有跨膜结构域,数目为2—8。根据系统进化分析将其分成Ces A与Csl两类,细分为Ces A、Csl A、Csl B、Csl C、Csl D、Csl E、Csl G共7组。基因结构分析显示,亚麻Ces A/Csls基因的长度在2.1—6.8 kb,外显子数量在2—14。保守基序分析表明,不同组间Motif组成有一定的差异,Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 12在Ces A、Csl B、Csl D、Csl E、Csl G组蛋白中均有分布,Motif 18、Motif 20在Csl A、Csl C组蛋白中均有分布,而Motif 13、Motif 14、Motif 15、Motif 19的分布则表现出一定的组间特异性。表达谱分析结果表明,Ces A/Csls家族成员在不同发育阶段表达模式不同,部分Ces A/Csls可被Na Cl、BR和Brz诱导上调或下调表达,预示Ces A/Csls功能的多样性以及在植物发育过程中扮演着不同角色。【结论】鉴定出45个亚麻Ces A/Csls家族基因成员,分属于两类,7组,分布于scaffolds上,基因结构和蛋白基序具有组间多样性和组内保守性。不同的基因在不同发育阶段具有一定的时空特异性。Ces A/Csls中部分基因响应激素BR、Brz及Na Cl胁迫。     

杉木纤维素合酶(ClCesA2)基因的克隆与表达分析

为探索杉木木材发育的分子机制,以杉木幼苗嫩叶总RNA为模板,利用反转录获得的cDNA进行聚合酶链式反应(PCR),获得杉木纤维素合酶(ClCesA2)基因。对该基因进行测序以及序列分析表明,该基因开放阅读框全长3 276 bp,共编码1 091个氨基酸,具有锌指结构和8个跨膜区域,及保守的DX……QVLRW结构域。荧光定量PCR结果表明,该基因在杉木的根、茎、叶中相对表达量有明显差异,茎的相对表达量最高,根次之,叶最低。系统进化树分析表明该基因与初生壁合成相关基因聚在一起,推测该基因可能参与杉木细胞初生壁的形成。     

菊芋查尔酮合成酶基因的克隆与表达分析

为揭示菊芋(Helianthus tuberosus L.)查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因的功能,以菊芋‘廊芋8号’叶片为材料,采用同源克隆和RT-PCR技术,克隆得到菊芋CHS基因命名为HtCHS,其编码区全长为1 197 bp(GenBank登录号MN124515),编码398个氨基酸。HtCHS的基因组DNA(gDNA)全长为1 567 bp,含2个外显子和1个内含子。序列比对和系统进化树分析显示,不同植物中的CHS氨基酸序列具有极高的同源性,菊芋与同属的向日葵CHS氨基酸序列一致性达到99.25%,共聚于一个分支。HtCHS蛋白相对分子质量为43.61 ku,等电点为6.33。HtCHS蛋白具有查尔酮合成酶结构域,属于查尔酮合成酶超家族成员,HtCHS不含信号肽和跨膜区,属于非分泌蛋白。实时荧光定量PCR结果显示,HtCHS在根中表达量最高。与对照相比,150 mmol·L~(-1) NaCl和20%PEG 6000处理6 h时HtCHS表达显著上调,处理12 h时显著下调。原核诱导表达分析结果显示,成功诱导出与预测蛋白大小一致的目的蛋白。     

人参CYP716A53v2基因的克隆与序列分析

研究人参皂苷生物合成途径中的影响因子。以五年生人参根组织为试验材料,提取总RNA,反转录合成c DNA的第1条链,利用PCR法对人参中的原人参三醇合成酶(CYP716A53v2)基因的c DNA进行克隆及序列分析。获得CYP716A53v2基因全长片段为1 506 bp,开放阅读框长1 410 bp,编码470个氨基酸多肽。生物信息学分析显示,CYP716A53v2基因编码蛋白质不含跨膜区域。说明CYP716A53v2基因与其他植物氨基酸序列具有较高同源性,其中与人参、西洋参、三七同源性分别为99%、98%、98%。     

东亚飞蝗储存蛋白基因LmiHex-2的克隆与表达分析

昆虫储存蛋白是在昆虫体内普遍存在的一种特异性淋巴蛋白,在昆虫的生长发育过程中发挥着重要作用。为分析东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis储存蛋白基因Lmi Hex-2的结构和时空表达特性,通过RACE技术获得了Lmi Hex-2基因2 171 bp全长c DNA序列,其中开放阅读框2 022 bp,编码673个氨基酸,预测分子量78.79 k Da。序列比对结果显示Lmi Hex-2基因c DNA序列与直翅目蝗总科储存蛋白基因c DNA序列的相似性达到82%~89%。RT-PCR结果显示Lmi Hex-2基因在东亚飞蝗卵和若虫阶段均有表达,5龄6 d时表达量最大;成虫中脂肪体表达量最高。通过贝叶斯法构建的系统发育树显示直翅目储存蛋白为单系群,昆虫血蓝蛋白与昆虫储存蛋白聚为姐妹群,二者均由甲壳纲血蓝蛋白进化而来。     

菲律宾蛤仔RP2基因的克隆及组织表达分析

采用反转录PCR(RT-PCR)与c DNA末端快速克隆(RACE)法首次从壳长为28 mm的菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum外套膜中克隆出RP2基因(Gen Bank登录号:KF826881)。结果表明:RP2基因c DNA序列长度为1158 bp,包括62 bp的5'端非编码区,41 bp的3'端非编码区,开放阅读框1053 bp,编码350个氨基酸;推导的氨基酸序列具有TBCC(57aa~175aa)和CARP(65aa~102aa)保守结构域,并为非跨膜糖蛋白;经Blast同源性比较表明,菲律宾蛤仔RP2氨基酸序列与太平洋牡蛎Crassostrea gigas的相似性较高(56%),与高等哺乳动物、鸟类、鱼类、两栖类和节肢动物各模式动物之间的相似性为43%~53%,与非洲眼线虫Loa loa的相似性较低(33%);利用实时定量PCR技术检测RP2基因在菲律宾蛤仔不同组织中的表达,结果显示,RP2基因在菲律宾蛤仔雄性性腺中表达量最高,在鳃、水管和外套膜组织中次之,在斧足和闭壳肌中表达量极少,在雌性性腺中无表达。研究表明,RP2基因在菲律宾蛤仔各组织中的表达较为广泛,但不同组织的表达量存在明显差异,本研究结果可为无脊椎动物RP2基因的结构及其功能研究提供基础数据。     

斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响

根据本实验室构建的斑节对虾(Penaeus monodon)c DNA文库得到的EST序列,利用RACE技术获得了斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因(Pm GS)的c DNA全长序列,进行了相关生物信息学分析,在此基础上采用荧光定量的方法研究了Pm GS基因在斑节对虾不同组织、氨氮胁迫过程中差异表达情况。该序列全长1 420bp,开放阅读框(ORF)为1 086 bp,3'非编码区(UTR)为294 bp,包括含有27个碱基的poly(A)尾,5'非编码区(UTR)为40 bp。ORF可编码361个氨基酸,预测分子量为40.423 ku,理论等电点为6.19。序列含有一个谷氨酰胺结合结构域(Gln-synt_C),8个磷酸化位点,2个糖基化位点。斑节对虾和中国明对虾的GS基因的相似性最高,达99%。Pm GS-mRNA在斑节对虾各组织中都有表达,在淋巴组织中表达量最高,其次为鳃组织,在胸神经中的表达量最低。96 h高浓度氨氮胁迫后,Pm GS-mRNA在肝胰腺中的表达水平显著高于对照组,但在鳃中的表达水平显著低于对照组(P0.05)。以上结果暗示,Pm GS在氨氮代谢方面具有重要的作用,可能参与了斑节对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。