杉木木糖合成酶基因ClUAXS2的全长克隆与分析

木糖合成酶UAXS基因是植物体内调控细胞壁中UDP-D-葡萄糖醛酸脱羧反应生成UDP-D-木糖/芹菜糖的关键性核苷糖合成酶,对植物细胞壁多糖物质的稳定合成和转换有重要意义。从杉木转录组中挑选获得木糖合成酶基因UAXS的中间序列,使用全长克隆技术和PCR技术克隆得到1个杉木木糖合成酶基因ClUAXS2。结果表明,ClUAXS2基因全长为1 753bp,包含的1 158bp的开放阅读框,可编码长度为386个氨基酸残基的蛋白质,其蛋白质分子式为C1936H3026N524O578S19,分子质量为43.90ku,等电位点为5.60。ClUAXS2基因为亲水性蛋白,没有信号肽结构域,编码1个疑似跨膜区域。蛋白质二级结构分析表明其蛋白主要骨架为Loop环和α-螺旋,预测亚细胞定位于细胞质中。通过对比分析发现ClUAXS2基因属于UAXS家族基因,编码1个UDP-D-Apiose/UDP-D-Xylose synthase 2(UAXS2)木糖酶蛋白。进化树分析结果显示,杉木ClUAXS2基因与无油樟(AtUAXS2)和可可树(TcUAXS2)的氨基酸序列相似度达到85%、86%,与拟南芥(AtAXS2),葡萄(VvUAXS)、毛果杨(PtAXS1)的氨基酸序列相似度为84%。实时荧光定量PCR结果表明,ClUAXS2基因在杉木的根、茎、叶中均有表达,但在1年生杉木幼苗茎中的表达量最高;ClUAXS2基因在不同杉木无性系茎中的表达量差异不显著,在根和叶中的表达量存在差异。     

一个新杉木纤维素合酶ClCesA基因的克隆与植物表达载体构建

为探索杉木木材形成的分子机制,以杉木嫩叶总RNA反转录的c DNA为模板,运用RT-PCR技术克隆出一个新杉木纤维素合酶基因ClCesA.该基因的开放阅读框(ORF)为2 955 bp,共编码984个氨基酸.通过TMHMM Server v.2.0和MEGA5.1软件预测ClCesA蛋白的跨膜结构和功能,发现该蛋白N端含有锌指结构,共有8个跨膜结构,平均跨膜区域18个氨基酸残基,并具有保守的DDDQXXLRW结构域.系统进化树分析结果表明,ClCesA可能与细胞次生壁形成有关.荧光定量PCR分析表明,ClCseA基因在杉木的不同器官(根、茎、叶)中均有表达,但在杉木根中的表达含量最高,茎中次之,叶中最低.随后,为后续该基因功能验证提供基础,将ClCesA克隆到含有GFP标签和潮霉素抗性的p GWB506载体,构建植物过表达载体p GWB506-35S-ClCesA-GFP.     

葡萄SVP类MADS-box基因的克隆及表达分析

从无核白葡萄(Vitis vinifera cv.Thompson seedless)中克隆获得一个胚珠发育相关MADS-box基因。该基因cDNA全长1 248bp,ORF为729bp,编码一个含有243个氨基酸的蛋白。氨基酸多序列比对和系统发育分析显示,该基因属于SVP类MADS-box基因。采用半定量技术进行表达分析表明,该基因在葡萄的根、茎、叶、花蕾、盛花和胚珠中均有表达,但是有强弱差异。实时定量PCR技术分析表明在无核葡萄品种无核白胚珠发育过程中基因表达量先升后降,而在有核葡萄品种黑比诺胚珠发育过程中表达量一直呈下降趋势。     

杉木纤维素合成酶基因CesA的克隆及表达分析

通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合c DNA末端快速扩增(RACE)技术,从杉木Cunninghamia lanceolata中克隆到2个全长为3 235 bp和3 876 bp的纤维素合成酶基因c DNA序列,被分别命名为Cl Ces A1和Cl Ces A2,Gen Bank登录号分别为JQ844574和JQ844575。相应编码蛋白分别包含992和1 092个氨基酸残基,推测分子量为111 845.3 D和123 105.7 D,等电点为6.04和6.65。氨基酸序列分析发现,它们具有植物纤维素合成酶基因相应的结构特征——锌指结构,2个易变区CSRI和CSRII,2个保守区CRI和CRII,纤维素合成酶底物结合结构域"D,D,D,QVLRW",以及8个跨膜区。荧光定量PCR分析表明:Cl Ces A1和Cl Ces A2基因在茎中表达丰度均为最高,且成熟木质部中表达量均高于皮层中的相应数值;2个基因在根和针叶中的表达量相对较低。以具特殊材质性状的矮生杉木和正常杉木木质部为材料的进一步表达分析发现:Cl Ces A1和Cl Ces A2在正常杉木木质部中的表达量大约是矮生杉木表达量的2~12倍。2个杉木Ces A基因可能在杉木木材形成过程中具有重要作用。     

蜡梅谷氧还蛋白基因CpGRX1的克隆与表达分析

通过随机挑取克隆测序的方法从蜡梅花cDNA文库中获得了蜡梅谷氧还蛋白基因,命名为CpGRX1 (Gen- Bank登录号:JQ990126).该基因cDNA全长为491bp,其中包含的开放阅读框长为321bp,编码蛋白分子量约为 11.18kD.生物信息学分析表明:CpGRX1蛋白属于典型的亚类I (即CPYC型)谷氧还蛋白.实时荧光定量PCR 分析表明:CpGRX1基因在蜡梅的根、茎、叶、花等组织中均有表达,其在茎中的表达量显著高于其它组织;在开 花过程中,CpGRX1基因在蕾期、盛开期和衰败期表达量较高,表明该基因可能与花的衰老过程相关.     

花生中一个NBS-LRR类基因的克隆和表达分析

本研究利用同源克隆方法,根据已知植物抗病(R)基因保守结构域设计一对简并引物,采用RTPCR方法对花生抗旱品种J11进行扩增,获得了一个通读的NBS-LRR类基因片段,命名为PDR1。PDR1长度为474 bp,核苷酸比较分析表明,PDR1与已克隆的大豆抗性基因(XM006573278)相似性为75%,与豌豆(AF123699)、苜蓿(XM003604518)抗性基因的相似性为74%;生物信息学预测其全长CDS编码框为5 838bp,编码的蛋白质含1 945个氨基酸,含有NB-ARC等保守结构域。荧光定量PCR分析表明,PDR1基因在花生幼苗根、茎、叶中均有表达,相对表达量为叶根茎;干旱胁迫后PDR1的相对表达量在12 h达到顶峰,随后下降,趋于平稳。本研究从花生中成功获得了NBS-LRR类基因的同源序列,为筛选新的抗旱花生种质提供了理论依据。     

人参达玛烷二醇合成酶基因的克隆、序列特征和组织表达分析

以五年生人参根组织为试验材料,利用RT-PCR方法克隆人参DS基因序列;通过生物信息学技术对其核苷酸序列和氨基酸序列进行比对;运用实时荧光定量PCR技术检测DS基因在人参根、茎、叶、果各部位的表达量。结果表明:获得人参DS基因c DNA全长,其核苷酸序列长为2.385 kb,含有1个开放阅读框,编码769个氨基酸多肽。生物信息学分析显示DS编码蛋白质包含1个跨膜区域,具有3个保守结构域。人参DS编码蛋白质与西洋参的DS(AGK62449)和三七的DS(AGI19258)具有99%的序列相似性。实时荧光定量PCR显示,DS基因在人参根、茎、叶、果各部位均有表达,在叶中表达量最高,其次是在果中,在根和茎中表达量相近。     

西瓜PME基因生物信息学分析及克隆

研究从拟南芥(Arabidopsis thaliana)4个果胶甲酯酶基因和2个来自东北农业大学西甜瓜分子育种课题组西瓜转录组数据分析的果胶甲酯酶基因入手,通过BLAST比对方法在葫芦科数据库中鉴定甜瓜(Cucumis melo L.)、西瓜(Citrullus lanatus)果胶甲酯酶同源基因,预测分析其生物信息学.结果表明,各级结构及理化性质与拟南芥果胶甲酯酶基因较为相似,并对其构建系统进化树,建树结果表明,葫芦科各物种间果胶甲酯酶基因家族同源性较高.此外,利用同源克隆方法获得Cla012554基因全长并分析该基因时空表达量,测序结果显示,克隆的Cla012554基因序列与比对序列间总体相似度为95.62％.实时荧光定量PCR分析表明,Cla012554基因在西瓜根、茎、叶和果肉中均表达,其中,茎表达量最高,根表达量最低.同时,Cla012554基因还可能参与西瓜果肉成熟软化.研究为进一步探究葫芦科作物PME基因功能提供重要参考.     

糜子PmASR2基因克隆与表达分析

为了解糜子PmASR2基因在逆境中(干旱、Na Cl、糖及各种植物激素胁迫)的作用,从河曲红糜子中克隆出PmASR2基因,其全长541 bp,保守域长336 bp,共编码112个蛋白,通过生物信息学分析可知,该基因是由缺水胁迫引起的植物ABA/WDS诱导蛋白质(ASR),且为亲水蛋白,糜子PmASR2基因分别在单子叶植物和双子叶植物之间进化保守(76.4%～86.4%),其中,与柳枝稷相似度最高(86.4%)。实时荧光定量PCR结果显示,PmASR2基因在PEG、甘露醇、ABA、过氧化氢、Na Cl、茉莉酸甲酯、生长素、水杨酸胁迫下基因相对表达量均发生改变,并且根>叶>茎,其中,在茎中相对表达量变化不明显。各种胁迫整体上相对表达量随时间增加呈现先升高后降低的变化趋势,赤霉素胁迫下该基因在糜子不同部位(根、茎、叶)中相对表达量未发生明显变化。     

龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（DLCCoAOMT）基因的克隆和表达分析

【目的】克隆龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(DLCCoAOMT)基因,分析其序列特征和在低温胁迫下不同组织中的表达情况并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术从龙眼叶片中克隆DLCCoAOMT基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,利用荧光定量PCR 研究DLCCoAOMT 基因在不同组织中的表达。【结果】克隆得到DLCCoAOMT 基因,GenBank 登录号为JN093023。该cDNA 全长993 bp,具有1 个744 bp 的完整开放阅读框（ORF）,编码247 个氨基酸。序列分析表明,DLCCoAOMT 编码的氨基酸序列与其它植物的 CCoAOMT 蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,龙眼 DLCCoAOMT 与桦木属的CCoAOMT 蛋白亲缘关系较近。利用荧光定量技术进行组织表达模式分析发现,DLCCoAOMT 基因在根、茎、叶中均有表达。总体上表达量在根和茎中较多,叶中较少,随着低温胁迫时间延长,DLCCoAOMT 基因在各组织的表达量也发生变化。原核表达结果表明,DLCCoAOMT 基因在大肠杆菌中获得表达。【结论】从龙眼中克隆到咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因,该基因可能参与调控低温胁迫。