猪圆环病毒研究进展

自20世纪70年代Tischer等首次发现猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)以来,随着对PCV的了解与研究的逐渐深入,发现由它引发的各种疾病对养猪业的影响越来越大,造成的各种损失日趋严重.     

猪传染性胃肠炎病毒基因工程研究进展

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)是猪的一种重要的传染病病毒，给养猪业造成巨大经济损失。近几年来，随着分子生物学技术的广泛应用．在TGEV的各个方面的研究都取得了长足进展．积累了丰富的资料。本文就来对TGEV的基因工程研究进展作一介绍。     

堆型艾美球虫广东株3—1E基因的克隆与序列分析

根据GenBank中登录的堆型艾美球虫3—1E基因序列，设计了3条引物，以广东株堆型艾美球虫裂殖子总RNA为模板，利用反转录一聚合酶链反应(RT—PCR)扩增获得了3—1E基因部分片段，将这一片段克隆至pGEM—TEasy载体中，经PCR、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。序列比较发现，所克隆的基因片段与Eimeria acervulina美国株(US)、E.acervulina QH株3—1E cDNA的核苷酸同源性分别为99．0％和99．2％，推导氨基酸的同源性分别为98．2％和97．6％。     

以免疫活性串联片段FB为抗原检测FMDV抗体的间接ELISA方法

将口蹄疫病毒免疫串联片段FB克隆至原核表达载体pBAD／TOPO中，得到重组质粒pBAD-FB，将此重组质粒转化到受体茵TOPIO中，以不同浓度的阿拉伯醛糖进行诱导，并在不同诱导时间进行采样，经处理后做SDS-PAGE、Western-blotting分析。结果发现以终浓度为0．02g／L的阿拉伯醛糖进行诱导，4h后表达量可达高峰，其大小约为26ku，扫描结果显示，FB融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的28．9％，能与抗FMDV抗体发生特异性反应，融合蛋白以包涵体和可溶形式存在。将融合蛋白的可溶性组分用500g／L Ni-NTA树脂过柱纯化后作为包被抗原，成功地建立了检测血清中FMD抗体的间接ELISA方法。融合蛋白的最佳包被浓度是40μg／mL；标准阳性血清的最适稀释倍数为1：160；最佳封闭液为50g／L脱脂奶粉和PBS；最佳封闭时间为1h。用建立的ELISA方法对采集的118份样品进行检测，并与全病毒包被抗原ELISA、间接血凝诊断试剂盒和UBI VP1抗体检测ELISA试验盒的检测结果比较，证明所建立的方法具有良好的特异性、敏感性和可重复性。     

猪圆环病毒Ⅱ型广东分离株全基因组的克隆和序列分析

分离了9株猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）广东地方分离株，并进行了全基因组序列测定；对这9株PCV2广东分离毒株的ORF1和ORF2基因的序列分析表明ORF2的变异程度要比ORF1的变异程度大；对PCV2衣壳蛋白的氨基酸序列同源性比较发现了PCV2毒株间存在1个氨基酸变异程度较大的区域和2个氨基酸变异程度较小的区域，其中前两个区域与两个主要的免疫反应区域相对应；将这9个毒株的全基因组序列与GenBank上收录的18个PCV2毒株的全基因组序列基因进化树分析表明，这9个PCV2广东分离株彼此之间及与国内PCV2分离株、欧洲株之间更接近，而与韩国、中国台湾、日本和美洲毒株之间则稍远，因而在选PCV2疫苗免疫时，建议尽量使用国内生产的疫苗或自制组织灭活疫苗进行免疫。     

囊素三肽的基因克隆和表达

以合成的BS1、BS2为引物扩增囊素三肽（BS）8串联片段（BS8）,克隆至pBAD/Thio-TOPO载体,用pBAD/TOPO（R）Thio大肠杆菌表达系统进行表达,含BS8融合蛋白的分子量大小约为19 kD,BS8融合蛋白主要以可溶形式存在.用蛋白质纯化树脂50%Ni-NTA纯化融合蛋白,高纯度的融合蛋白经透析除咪唑、浓缩后,再经胰蛋白酶水解获得大量BS单体.高压液相色谱分析表明,经过DEAE阴离子交换层析,获得纯化的BS单体.     

霉菌毒素对畜禽免疫机能的影响

据统计，世界上每年大约有25％的谷物被霉菌毒素所污染，因而造成人和动物健康的隐形损害以及很大的经济损失；我国一些地区的饲料霉变问题相当严重，对畜牧业生产造成了巨大的损失。近年来，由于全球气候温室效应日趋明显，饲料和饲料原料贸易的日益全球化增加了储存和运输的时间，霉菌及霉菌毒素的污染比以前更加严重。Wang等（2003）分析中国配合饲料样品，结果显示，超过90％的样品中含有黄曲霉毒素（Aflatoxin，AF）、（Oehratoxin，OT）、T-2毒素（T-2 Toxin）、烟曲霉毒素（Fumonisins）、呕吐毒素（Deoxyniralenol，DON）和玉米赤霉烯酮（Zeaya lenone，ZON）6种霉菌毒素。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株与猪瘟病毒等混合感染的调查与分析

从华南地区PRRSV变异株(NSP21 594-1 680 bp缺失)核酸阳性的23个规模场、42个个体养殖场和15个散养户,随机采集发病、同群猪血清197份、组织样品115份,调查猪群个体感染PRRSV变异株情况,并对PRRSV变异株核酸阳性样品进行CSFV、PRV、PCV2、SIV检测,调查PRRSV变异株混合感染情况.结果表明:312份样品中224份PRRSV变异株核酸阳性,阳性率71.79%;PRRSV变异株核酸阳性样品中CSFV、PRV、PCV2核酸阳性样品分别为12份、2份,35份,阳性率分别为5.35%、0.89%、15.6%;80个场(群)均未检测到SIV核酸的存在.25个场(群)存在病毒混合感染,其中PRRSV变异株/CSFV、PRRSV变异株/PRV、PRRSV变异株/PCV2二重感染和PRRSV变异株/CSFV/PCV2、PRRSV变异株/PRV/PCV2三重感染猪场(群)百分率分别为5%、1.25%、21.25%和2.5%、1.25%.PRRSV变异株(NSP21594-1680变异)是造成猪场(群)重大损失的直接原因,并可与CSFV、PRV、PCV2等病毒出现混合感染,与PCV2混合感染比率较高.     

猪流行性腹泻病毒全病毒灭活疫苗量效关系研究

本研究旨在探索猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)灭活疫苗不同抗原含量对仔猪感染的保护作用。测定不同浓缩倍数PEDV感染性病毒粒子数和病毒粒子总数,用不同浓缩倍数抗原分别制备灭活疫苗免疫小鼠,利用ELISA抗体检测方法、中和试验、ELISPOT方法测定体液免疫与细胞免疫产生情况,筛选合适抗原含量疫苗进行仔猪免疫并测定抗体,利用攻毒试验研究浓缩疫苗与保护之间的关系。结果显示,当抗原含量达8×10⁶ pfu·mL^-1以上时,灭活疫苗能有效刺激小鼠产生体液免疫及细胞免疫。以2 mL含8×10⁶ pfu·mL^-1抗原的灭活PEDV疫苗免疫仔猪可抵抗PEDV攻毒引起的腹泻及连续排毒,相较于总病毒粒子数,感染性病毒粒子数与抗体产生呈显著相关(r = 0.998 1),中和效价与仔猪保护呈显著相关性(r=0.974 7)。PEDV灭活疫苗可以提供良好的免疫保护,其中感染性病毒数量是提升抗体水平的关键因子,抗体滴度作为一项体液免疫的指标是判断免疫保护的重要参考。     

猪圆环病毒Ⅱ型衣壳蛋白片段与T4噬菌体SOC蛋白的融合表达

将PCV2衣壳蛋白片段与T4噬菌体SOC蛋白在大肠杆菌中融合表达。利用PCR技术扩增猪圆环病毒Cap基因。将Cap基因克隆至T4噬菌体表达质粒pSOC的SOC基因（T4噬菌体表面非结构蛋白基因）下游,构建成T4噬菌体SOC位点表达Cap的表达载体pSOC-Cap。将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后表达的目的蛋白SOC-Cap进行SDS-PAGE与Western-blot方法检测。表达的SOC-Cap蛋白相对分子质量约28kD,表达量占菌体总蛋白量的22.31%,并具有与PCV2特异性抗体反应的活性。PCV2衣壳蛋白片段与T4噬菌体SOC蛋白的融合表达后,表达量较高,并具有免疫活性,有望用于猪圆环病毒II型的诊断和预防。