建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒联合免疫胶体金试纸条的研制及应用

为了实现兰花种植苗圃和口岸一线直接检测样品中建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus(CymMV)和齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus(ORSV)的目的,我们研制了上述两种病毒联合免疫胶体金检测试纸条。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记单抗C10并固定于胶金垫上;将抗体5B7和4F3分别固定于硝酸纤维素膜上作为检测线,将羊抗鼠抗体包被固定于硝酸纤维素膜上作为质控线,经优化后组装胶体金试纸条。结果表明研制的联合试纸条特异性强,能够在10min之内同时检出两种病毒,操作简便。对两个种植苗圃的93份兰花样品进行实际检测所得结果与ELISA的检测结果符合性好(Kappa值分别为84.6%和86.7%),能满足兰花样品中建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的初筛要求。     

2011-2012年三种水稻矮缩病在我国的分布及发生调查

水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒和水稻锯齿矮缩病毒均可以引起水稻矮缩病。于2011-2012年,利用dot-ELISA和RT-PCR方法对江苏、浙江、江西、广西、海南、云南、贵州、四川、重庆、湖南等省的水稻矮缩病进行调查。检测结果表明,2011年水稻中3种矮缩病的病毒感染率分别为：水稻黑条矮缩病毒10.92%,南方水稻黑条矮缩病毒30.67%,水稻齿叶矮缩病毒4.62%。2012年水稻中3种矮缩病的病毒感染率分别为：水稻黑条矮缩病毒0.40%,南方水稻黑条矮缩病毒48.38%,水稻齿叶矮缩病毒26.32%。检测结果说明2012年的南方水稻黑条矮缩病害、水稻齿叶矮缩病害重于2011年,水稻黑条矮缩病害轻于2011年。水稻黑条矮缩病主要发生于江苏、浙江等省;南方水稻黑条矮缩病主要在广西、海南、云南、贵州、重庆、浙江等省区流行;水稻齿叶矮缩病在广西、海南、云南等地均有发生,且往往与南方水稻黑条矮缩病毒复合感染。     

庆大霉素单克隆抗体的研制及ELISA分析方法的建立

用与牛血清蛋白(BSA)交联的庆大霉素人工抗原(GM-BSA)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选、克隆,得到1株能稳定分泌抗庆大霉素单抗的杂交瘤细胞株(6H8),经鉴定6H8的抗体类型及亚类均为IgG1,其轻链为κ链.制备单克隆抗体腹水,腹水的间接ELISA效价在1×10-7以上.该单克隆抗体与庆大霉素结构类似物均无交叉反应,具有高度特异性.以制备的单抗建立间接竞争ELISA方法,其线性回归方程为y=16.122ln(x)-2.0143(R2=0.9934),抑制中浓度IC50为25.2μg·L-1,最低检测限IC20为3.9μg·L-1.竞争ELISA方法检测鲜奶中的庆大霉素平均回收率在92％～110％之间.抗庆大霉素单抗的制备和竞争ELISA方法的建立为庆大霉素快速检测奠定了基础.     

西瓜花叶病毒（WMV）单克隆抗体的制备及其应用

【目的】制备抗西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus, WMV）的特异性单克隆抗体,并以其为核心建立能快速有效地检测WMV的血清学方法,从而为中国田间西瓜花叶病毒病的诊断和检测、预测预警及科学防控体系的建立提供物质和技术支撑。【方法】用提纯的WMV病毒粒子免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和细胞培养、抗体筛选和细胞克隆等杂交瘤细胞技术,获得能稳定分泌抗WMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔制备其单抗腹水,并以制备的单抗为核心建立能准确、特异、灵敏地检测田间植物中WMV的ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA、Tissue blot-ELISA和IC-RT-PCR方法,以及能检测单头传毒介体蚜虫体内WMV的dot-ELISA方法。【结果】3株能稳定分泌WMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株（2C8、15A8和16C12）及其单抗腹水被制备,3株杂交瘤细胞分泌的单抗腹水的间接ELISA效价均达到了10-6以上,抗体类型及亚类均为IgG1、kappa轻链。Western blot分析发现,这3个单抗均与WMV的外壳蛋白亚基有特异性反应。灵敏度分析结果表明,ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA和IC-RT-PCR方法检测WMV病叶的灵敏度分别达到1﹕163 840、1﹕327 680、1﹕5 120和1﹕1 310 720倍稀释（w/v,g/mL）。特异性分析结果表明,以这3个单抗为核心建立的ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA、Tissue blot-ELISA和IC-RT-PCR 5种血清学检测方法均能与感染WMV的病叶发生特异性免疫反应,而与感染小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的植物样品、健康白南瓜、西瓜、葫芦和烟草的植物组织均呈阴性反应,且dot-ELISA方法还能特异性地检测单头蚜虫体内的WMV,而在检测无毒蚜虫时呈阴性反应。利用建立的血清学检测方法对采自浙江省、江苏省、山东省和海南省的275株葫芦科疑似病株进行检测,结果发现187株植物感染WMV,发病率达68%,说明WMV在中国田间葫芦科植物中广泛流行发生,且血清学方法的检测结果与RT-PCR方法的检测结果完全一致,将部分PCR产物进行核酸测序和序列比对分析,结果表明这些PCR产物是WMV CP基因片段,证明血清学方法检测阳性的样品确实感染WMV。【结论】获得了3株特异、灵敏的WMV单克隆抗体,以其为核心建立的5种血清学方法能准确、灵敏、可靠地应用于田间样品中WMV的检测,从而为中国WMV田间样品的大规模快速检测和诊断、该病害预报预警和科学防控提供物质和技术支撑。     

番茄斑萎病毒外壳蛋白原核表达及Dot blot ELISA检测方法的建立

     将番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)全长外壳蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中,经限制性酶切分析及测序结果表明插入方向正确且阅读框架无移码突变.将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),SDS-PAGE分析结果证实IPTG可诱导1个分子量约为48 kDa的融合蛋白表达.利用6×His标签单抗和TSWV FoPaTs1多抗证实所表达的蛋白为TSWV外壳蛋白.以纯化的重组外壳蛋白免疫小鼠,制备杂交瘤细胞培养上清单抗,并用杂交瘤细胞培养液上清建立了可靠、有效检测TSWV的Dot-blot ELISA方法.     

BBTV单克隆抗体的制备及其检测应用

香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)是危害香蕉(Musa paradisiaca)生产的重要病毒.本研究旨在以制备的抗BBTV特异性单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)为核心建立检测BBTV的血清学方法,从而为该病毒的诊断和科学防控提供技术支撑.通过改进提纯方法获得了提纯的BBTV,以BBTV病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),经细胞筛选和克隆,获得1株分泌抗BBTV单克隆抗体的杂交瘤细胞22E3,并制备其单抗腹水.用间接酶联免疫吸附试验(indirect-enzyme-linked immunosorbent assay,in-ELISA)方法测定制备的单抗腹水效价达到10-7,抗体类型及亚类为IgG1,κ轻链.Western blot检测表明,该单抗与BBTV外壳蛋白亚基有特异性反应.利用制备的单抗建立了检测BBTV的斑点酶联免疫吸附试验(dot-ELISA).该方法检测感染BBTV香蕉植物组织粗提液呈特异性阳性反应,而和健康香蕉组织呈阴性反应,说明建立的dot-ELISA方法能特异性地检测香蕉植物组织中的BBTV.灵敏度分析表明,以22E3单抗为核心建立的dot-ELISA方法检测香蕉病组织的灵敏度达1∶640(W/V,g/mL).田间样品检测结果表明,建立的dot-ELISA方法能准确、可靠地用于香蕉中BBTV病毒的检测.BBTV单克隆抗体的制备及其dot-ELISA血清学检测方法的建立为我国香蕉上BBTV的诊断、无毒苗的生产及科学防控提供了物质和技术支撑.     

抗鸭IL-2单克隆抗体的制备与鉴定

用纯化的重组鸭IL-2蛋白免疫BALB/c 小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞进行筛选,阳性孔经三次有限稀释法克隆,成功获得5株能稳定传代并分泌抗鸭IL-2单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞,分别命名为:1H4、2B3、4G12、5F6、5H6,其中一株对鸡IL-2具有交叉反应性.各单克隆抗体腹水间接ELISA效价在1∶32000～1∶512000之间,抗体类型除mAb 5H6为IgG2a亚类外,其余4株mAb均为IgG1亚类,5株mAb的轻链都为κ链.经Western-blot分析表明,所获得的5株抗鸭IL-2单克隆抗体与鸭IL-2具有反应性,推测它们是针对序列决定簇的.     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建

以含鸡传染性法氏囊病病毒(杭州分离株,HZ96)VP2基因的质粒 PBS为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到1.5 kb左右长的VP2基因产物;用KpnⅠ和 SalⅠ酶切纯化的PCR产物;将纯化的酶切产物在 T4 DNA连接酶的作用下定向克隆到植物表达载体Cambia1301 水稻胚乳特异性启动子GT1下游, 并经PCR、酶切和测序鉴定.植物重组表达载体经三亲交配已导入根癌农杆菌中.