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猪干扰素α在昆虫细胞中分泌表达及其抗病毒活性检测 总被引:3,自引:1,他引:2
【目的】为获得重组猪干扰素α。【方法】本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪干扰素α基因插入供体质粒pFastBacⅠ多克隆位点,置于pH启动子控制下,昆虫可识别的蜂素信号肽(honeybee melittin signal peptide,HBM)取代猪干扰素α原有信号肽以实现分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。【结果】重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blot证明重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性,结果表明:昆虫细胞上清的抗病毒效价达到1.07×105 U?ml-1,昆虫细胞裂解液的抗病毒效价为3.15×104 U?ml-1。【结论】应用蜂素信号肽实现猪干扰素α在昆虫细胞上分泌表达,为临床上防治猪病毒性疫病奠定了基础。 相似文献
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绿原酸对猪繁殖与呼吸综合征病毒体外作用的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
通过观察金银花的主要成分绿原酸对Marc-145细胞病变效应(CPE)来评价绿原酸不同加药方式(先加药后接种病毒,先接种病毒后加药)体外
对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的作用效果。结果表明,在安全浓度范围内,绿原酸对PRRSV具有显著的体外抑制作用和阻断作用,其对
PRRSV的最小抑制浓度为0.391 μg/mL,最小阻断浓度为0.0977 μg/mL。 相似文献
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根据GenBank基因库中人β2微球蛋白(β2m)成熟肽基因序列设计2对引物,使用RT-PCR法从健康人血液中扩增人β2m成熟肽基因,扩增产物进行T-A克隆和测序.结果表明,获得的人β2m成熟肽基因为297 bp,与模板序列的同源性为100%.利用基因重组技术,将β2m成熟肽基因亚克隆入pET-28a(+)载体中,经PCR、酶切和测序鉴定,证实所获重组表达质粒pET-28/Humβ2m中含有目的片段,且连接、构建正确,表明成功构建了重组表达质粒pET-28/Ham β2m. 相似文献
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【目的】克隆鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pET/DuMHC-Ⅰ。【方法】依据GenBank/DDBJ/EMBL基因库中公布的鸭MHC-Ⅰ基因序列设计1对引物,采用RT-PCR技术从鸳鸯鸭脾脏组织中扩增MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因cDNA,T-A克隆到pGEM-T Easy载体中,并进行测序。通过PCR和酶切的方法,将鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因亚克隆入pET-28a(+)载体,构建重组表达质粒pET/Du MHC-Ⅰ,并进行PCR、NcoⅠ和NotⅠ双酶切及测序鉴定。【结果】测序结果表明,获得了MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因,其长度为813 bp,编码271个氨基酸。MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因与GenBank中登录的鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因序列的同源性为89.4%~91.7%,氨基酸同源性为78.2%~83.7%;与鸡、鹅、鹌鹑、草鱼、狗、猪、鼠和人的MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽氨基酸序列的同源性分别为64.6%,79.3%,59.4%,41.0%,26.6%,45.0%,12.5%和22.1%,这表明MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因存在着种属多样性,且亲缘关系越近,同源性越高。所获重组表达质粒pET/Du MHC-Ⅰ经PCR、酶切、测序鉴定,证实鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因cDNA已正确克隆入pET-28a(+)表达载体。【结论】成功克隆出鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因,并构建了重组表达质粒pET/Du MHC-Ⅰ。 相似文献
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研究猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)感染猪肾传代细胞(PK-15 cells)后Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)表达水平变化情况,为探明PPV感染机制提供理论基础。试验利用荧光定量PCR方法检测PPV感染PK-15细胞后TLR1-10的转录时相变化。结果显示,PPV感染PK-15细胞后,TLR1在PPV感染后3h表达上调,约为对照组细胞的3.1倍,其他时段均低于正常水平;TLR3和TLR7 mRNA表达水平在病毒感染早期均低于正常水平;TLR4和TLR8的mRNA含量均在感染后3、12、36 h表达上调,TLR10分别在在3h和36 h表达上调,其他时段均不同程度的降低;而TLR2和TLR9 mRNA表达水平在感染后24 h开始升高,并于48 h达到峰值,分别为对照水平的10.1倍和26.7倍。研究表明,PPV感染PK-15细胞后能够诱导细胞上TLR2和TLR9在mRNA水平显著上调,PPV感染可能通过TLR2和TLR9受体介导感染。 相似文献
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实时荧光定量PCR检测H1N1亚型猪流感病毒 总被引:12,自引:0,他引:12
根据GenBank中H1N1亚型猪流感病毒NP基因的序列(DQ889686),利用Premier express设计并合成1对引物和相应的TaqMan探针,从猪流感病毒HN407株接种的鸡胚尿囊液中提取总RNA,经RT-PCR扩增NP基因。将鉴定正确的NP基因片段克隆入pGEM-T Easy载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒。以该阳性重组质粒为荧光定量PCR标准品模板建立标准曲线。对探针浓度、引物浓度、镁离子浓度和退火温度进行优化,建立了最佳的荧光定量PCR反应体系和扩增程序。经临床应用表明荧光定量PCR的建立为早期诊断猪流感病毒、定量分析猪流感病毒感染程度奠定了基础。 相似文献