狸猫α-干扰素全基因的克隆及生物信息学分析

根据猫α-干扰素基因核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增狸猫α-干扰素全基因,并克隆、测序。用DNAStar软件及在线分析方法对克隆的IFN-α基因核苷酸及其推导氨基酸序列进行分析,并与人和其他种动物的IFN-α基因进行同源性和进化分析。结果表明,获得了狸猫α-干扰素全基因序列,其大小为631 bp,编码194个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有1个潜在的N-糖基化位点和7个潜在的O-糖基化位点。IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高。狸猫IFN-α基因的成功克隆为进一步研究猫IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础。     

PDCoV感染对仔猪全身免疫器官的影响

旨在研究猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)感染对仔猪免疫系统的影响。选取10头5日龄健康仔猪随机分为空白对照组和PDCoV感染组(n=5),PDCoV感染72 h后剖解仔猪，采集仔猪的胸腺、扁桃体、脾脏和淋巴结(颈浅淋巴结、腹股沟淋巴结、髂下淋巴结、下颌淋巴结和肠系膜淋巴结),4%(g/L)的多聚甲醛溶液固定，苏木精-伊红染色观察免疫系统病理变化，免疫组织化学检测病毒分布。苏木精-伊红染色结果显示，PDCoV感染仔猪后脾和淋巴结都出现了明显的病理损伤。脾小梁增生；红髓增多，红髓和白髓界线不清、分布铁黄素颗粒；白髓萎缩，脾小结减少，淋巴细胞减少。淋巴结局部组织出现毛细血管充血或轻微出血，皮质和髓质界线不清，淋巴小结体积增大，数量增多，生发中心明显变大。免疫组织化学结果显示，仔猪肠系膜淋巴结有大量病毒分布，下颌淋巴结存在少量病毒，其余免疫组织无病毒分布。上述结果说明，PDCoV感染后可引起仔猪免疫器官产生病理损伤，降低仔猪的免疫功能，这为深入了解PDCoV致病机制和临床防控提供了理论依据。     

肽核酸在疾病诊疗中的应用

肽核酸是一类新型信息分子,具有不带电荷的类似肽链的骨架结构并带有碱基,能与DNA和RNA特异性杂交,能调节基因的复制、转录(或逆转录)和翻译过程,在疾病的分子诊断和治疗方面有着广泛的应用前景.     

猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。参照GenBank中PDCoV有关基因序列,设计一对特异性引物用于扩增PDCoV M 基因。将测序正确的基因片段克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒作为建立标准曲线的病毒模板。设计合成一对特异性引物与TaqMan探针,进行反应条件和反应体系的优化,建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并进行该方法的灵敏性、特异性与重复性验证。结果表明,该方法能有效扩增1.0×10^1 ~1.0×10^9 拷贝·μL^-1 的PDCoV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为1.0×10^1 拷贝·μL^-1;对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%,重复性良好。对2017—2018年期间收集的河南省不同猪场的100份腹泻病料进行检测,PDCoV的阳性检出率为23%(23/100),与PDCoV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。人工感染PDCoV的仔猪,取攻毒后不同时间的粪便样品,应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度远远优于常规RT-PCR。上述结果表明,本研究所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法能够灵敏、特异地检测PDCoV,可用于临床PDCoV的检测。     

不同品种猪IFN-α基因的克隆与序列分析

根据现有猪α干扰素(IFN-α)基因序列设计引物,应用PCR技术直接从肝组织基因组中扩增丹系长白和法系长白、英系大白和法系大白猪IFN-α基因。将克隆得到的特异性片段克隆入pGEM-TEasy载体中,转化感受态细胞JM109,运用蓝白斑筛选、质粒PCR鉴定及酶切鉴定筛选阳性可疑菌株,并将筛选的阳性株进行测序。结果表明,得到了上述4个品系的猪IFN-α基因。核苷酸同源性均在97.2%以上,氨基酸同源性均在92.8%以上。     

不同毒株猪细小病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用PCR扩增了猪细小病毒NJ-1株、NJ-2株、7909株和Vaccine株的VP2基因,分别克隆于pGEM-TEasy载体中,测定其核苷酸序列,并推导出相应的氨基酸序列,对其核苷酸和氨基酸序列进行分析和同源性比较。所测4个序列中,NJ-1株、NJ-2株和7909株序列均为1437bp,共编码479个氨基酸;而Vaccine序列为657bp,比其他毒株缺失780bp,共编码219个氨基酸。将所得4个序列与GenBank中NADL-2株、Kresse株、China株及VR-1株相应的核苷酸及氨基酸进行同源性比较,发现其核苷酸和氨基酸的同源性分别在97.7%~99.9%和97.2%~99.2%之间,具有高度同源性;通过绘制系统进化树可知,分离自国内的China株、NJ-1株、NJ-2株、7909株及Vaccine株亲缘性最为相近,与其他毒株的亲缘关系较远。     

复方芩连汤对几种禽病病毒体外增殖的抑制作用

以黄连、黄芩、板蓝根、黄芪等为主要成分的复方芩连汤作为抗病毒药,利用细胞病变(CPE)抑制试验测定中药复方在长成单层的鸡胚成纤维细胞(CEFC)上对鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)等几种禽病病毒的抑制作用。结果表明:中药复方对NDV具有较好的抑制作用,其最小直接杀灭浓度为7.81μg/mL,最小阻断浓度为3.9μg/mL,最小治疗浓度为15.62μg/mL;中药复方在体外对IBV的T株和M41株也具有显著定的抑制作用,而对IBDV的抑制作用则不明显。     

猪细小病毒Vaccine株VP2基因克隆与抗原性分析

[目的]为研制和筛选猪细小病毒核酸疫苗提供依据。[方法]对猪细小病毒Vaccine株VP2进行克隆、测序以及抗原性分析。[结果]参考GenBank公布的NADL-2株序列,设计出1对引物,并利用该引物扩增了猪细小病毒vaccine株VP2主要抗原基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体上,测序获得656 bp核苷酸序列,并推导出其氨基酸序列,共编码218氨基酸,与NADL-2株相应的序列进行比较分析,比NADL-2毒株缺失781 bp,两者核苷酸同源性为98.9%,氨基酸同源性为97.2%;应用DNAStar软件对氨基酸的抗原表位进行了预测,共有7个抗原表位,分别在氨基酸N端的第10~183、4~39、94~103、121~126、137~144、156~165和209~214区段,此序列具有较好的免疫原性。[结论]该研究为发展特异性和敏感性诊断系统和研制疫苗提供了有力的技术依据,为研究蛋白质特性分析提供了理论依据。     

酵母蛋白替代进口鱼粉对断奶仔猪 生产性能的影响

试验将60头28日龄断奶的健康、体重相近（7.63μ0.52kg）的长大二元杂交商品仔猪按体重、性别,随机分为5组,即对照组和4个试验组,对照组即原用进口鱼粉配方组,第1、2、3、4试验组为分别用山东济宁圣齐生物生物工程生产的活性酵母蛋白粉替代25%、50%、75%和100%的进口鱼粉组,共试验4w。研究添加不同水平酵母蛋白粉对断奶仔猪生产性能的影响。结果表明：断奶仔猪日粮中添加酵母蛋白替代进口鱼粉后均没有显著改变原添加进口鱼粉仔猪断奶后0~4w的平均日采食量和平均日增重,饲喂效果较好。综合各项试验指标,酵母蛋白粉以50%~75%的比例替代进口鱼粉,添加到断奶仔猪日粮中对仔猪生产性能有明显的促进作用,且饲料成本下降。     

表面活性素体外抗新城疫病毒活性研究

研究了表面活性素(Surfactin)的体外抗新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV) lasota株效果.观察表面活性素的细胞毒性、对NDV直接灭活作用、抗NDV吸附作用及对NDV生物合成抑制作用.结果表明生物表面活性素对鸡胚成纤维(Chicken Embryo Fibroblasts,CEV)细胞的TD50和TD0分别为62.5、16.125μg/ml;具有直接灭活NDV及抗其吸附效果,可剂量依赖性抑制NDV生物合成.