玉米大斑病菌亲环素基因的克隆及表达规律分析

利用简并引物PCR结合RACE技术获得S. turcica中亲环素基因的全长,并通过Real-time PCR技术检测该基因在病菌侵染结构发育过程中的表达模式。结果表明,玉米大斑病菌亲环素基因开放阅读框全长1 125 bp,3′UTR 154 bp,5′UTR 93 bp,编码374个氨基酸,将此基因命名为CyPs1,并将其cDNA序列提交GenBank,获得登录号EU679371.1,Protein ID为ACD62431.1。系统发育树分析显示,CyPs1与玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、蓝莓枯枝病菌(Neofusicoccum parvum)等物种的亲环素同源性可达到90%以上。该基因在病菌分生孢子萌发、附着胞形成及侵染阶段均有表达,至附着胞形成和侵染菌丝形成阶段,转录水平分别升至分生孢子时期的2倍和3倍。     

灰葡萄孢PKA编码基因在病菌生长发育和致病过程中的功能

为明确灰葡萄孢cAMP信号途径中蛋白激酶A的催化亚基基因pka1、pka2和调节亚基基因pkaR在病菌生长、发育和致病过程中的功能,本研究构建了灰葡萄孢pka1、pka2和pkaR基因的RNAi突变体,以野生型菌株BC22为对照,对pka1、pka2和pkaR基因的RNAi突变体的表型和致病力进行分析,发现pka1基因的RNAi突变体的生长速率明显减慢、菌丝细胞变短、分生孢子产量增加、致病力减弱,菌落颜色、形态以及穿透寄主组织的能力与野生型没有明显差别;pka2基因RNAi突变体的菌丝较野生型明显变细,分生孢子产量降低,生长速率、致病力和穿透寄主组织的能力与野生型没有明显差别;pkaR基因RNAi突变体的菌丝变细,生长速率减慢,分生孢子产量降低,致病力减弱,穿透寄主组织的能力与野生型没有明显差别。结果表明:灰葡萄孢pka1基因正调控病菌的生长、菌丝发育和致病力,负调控分生孢子的形成;pka2基因正调控病菌的菌丝发育和分生孢子的形成;pkaR基因正调控病菌的生长、菌丝发育、分生孢子的形成和病菌的致病力。     

灰葡萄孢致病基因BcKMO与病菌MAPK信号途径的关系

为明确灰葡萄孢致病基因BcKMO与病菌MAPK信号途径之间的关系,利用MAPK信号途径特异性的抑制剂U0126处理灰葡萄孢野生型菌株BC22、BcKMO基因的T-DNA插入突变体BCG183和回复突变体BCG183/BcKMO。结果发现,突变体BCG183对抑制剂U0126不敏感,受抑制的程度显著低于野生型和回复突变体。对BcKMO基因与MAPK信号途径关键基因bmp1和bmp3的表达规律进行分析,结果发现,BcKMO与bmp3均是在7 d的菌丝和菌核中表达水平较高,BcKMO与bmp1、bmp3基因均是在含蔗糖和果糖培养基上培养的病菌中表达水平较高。利用Real-time PCR技术,检测BcKMO基因突变对bmp1、bmp3基因表达的影响以及bmp1、bmp3基因突变对BcKMO基因表达的影响,结果发现,突变体BCG183中bmp1的表达水平均显著高于野生型和回复突变体,bmp3的表达水平显著低于野生型和回复突变体; bmp1的RNAi突变体中BcKMO基因表达水平显著高于野生型,而bmp3基因的RNAi突变体中BcKMO基因表达水平显著低于野生型。结果表明,BcKMO基因负调控bmp1的表达,正调控bmp3的表达;而bmp1负调控BcKMO基因的表达,bmp3正调控BcKMO基因的表达。研究结果可为阐明灰葡萄孢BcKMO基因调控病菌生长、发育和致病力的机制奠定基础。     

雷帕霉素的水解行为及对4种非靶标生物的急性毒性

雷帕霉素为大环内脂类抗生素药剂,对多种人类疾病有效,近年发现其对多种植物病原真菌也有较好的抑制活性,有望开发为微生物源农药用于植物病害的防治,而目前关于雷帕霉素的水解行为及其对非靶标生物的急性毒性还未见报道。为评价雷帕霉素的水解行为及其对非靶标生物的急性毒性,本研究通过室内模拟试验,测定了雷帕霉素在不同pH值、温度、初始浓度及光源中的水解特性,同时测定了其对家蚕、意大利工蜂、斑马鱼及赤子爱胜蚯蚓4种非靶标生物的急性毒性。水解试验结果表明:碱性环境、紫外光照及高温有利于雷帕霉素的水解。当其初始质量浓度为10 mg/L时,半衰期分别为66.63、38.93及77.00 h;初始质量浓度为50 mg/L时,半衰期分别为144.38、105.00及165.00 h。急性毒性试验结果表明:雷帕霉素对家蚕和斑马鱼的96 h-LC₅₀值分别为 386.46和3.50 mg/L (有效成分,下同);对意大利工蜂的急性经口毒性48 h-LD₅₀值为8.95 μg/bee,急性接触毒性48 h-LD₅₀值为16.79 μg/bee;对赤子爱胜蚯蚓的14 d-LC₅₀值为223. 81 mg/kg。按照 “化学农药环境安全评价准则” (GB/T 31270—2014) 的毒性等级划分标准,雷帕霉素对家蚕、斑马鱼、赤子爱胜蚯蚓的急性毒性分别为 “低毒”、“中毒” 和 “低毒”,对意大利工蜂的急性经口毒性为 “中毒”,急性接触毒性为 “低毒”。研究表明,雷帕霉素属于易降解性药剂,对家蚕、意大利工蜂、斑马鱼及赤子爱胜蚯蚓4种非靶标生物安全。     

两步扩增法在玉米抗大斑病相关基因片段分离中的应用

对一步扩增法和两步扩增法在DDRT-PCR中的扩增效率进行了比较,结果发现,两种方法得到的片段大小都在150~1500 bp之间,但条带数量和清晰度不同。一步扩增法得到的扩增条带为30~45 条,条带较模糊,两步扩增法得到的扩增条带为40~60条,条带清晰。一步扩增法获得102 条玉米抗大斑病差异表达条带,只有55条带中的cDNA能够成功回收并产生有效扩增,差异条带回收率为53 9%,而两步扩增法获得了148条差异条带,其中138条带都能得到有效回收和扩增,回收率达93 2%。因此,两步扩增法更有利于差异条带的回收和二次扩增。     

北京、宁夏甜椒上分离的黄瓜花叶病毒CP基因序列分析及亚组鉴定

从宁夏和北京地区甜椒上分离到3个黄瓜花叶病毒分离物(宁夏分离物为CMV-NX1,NX2;北京分离物为CMV-BJ)并保存在普通烟上。从叶片中提取该病毒RNA,经RT-PCR扩增到780bp的全长CP基因的cDNA,PCR产物纯化并测序。2个宁夏分离物(NX1,NX2)核甘酸序列同源性为100%,它们为同一株系。与已报道的部分CMV株系的CP基因序列相比较,表明3个分离物与CMV亚组I同源关系比亚组II更密切,因而3个分离物都属于黄瓜花叶病毒亚组I,通过DAS-ELISA进一步验证它们都属于亚组I。     

高效液相色谱柱后衍生法测定农田沟渠水中草甘膦残留

为了准确评价草甘膦在农田沟渠水中使用后其对生态环境的安全性,建立了高效液相色谱(HPLC)-柱后衍生法对农田沟渠水中草甘膦残留量的检测方法。将田间沟渠水样中草甘膦经次氯酸钠和邻苯二甲醛、巯基乙醇衍生化后,采用荧光检测器检测。衍生剂1(5%)次氯酸钠添加量100μL/L;衍生剂2硼酸钾和OPA添加量分别是130g/L和100mg/950mL。草甘膦在0.05～2mg/L范围内线性良好,相关系数为0.999 9。在农田沟渠水中,草甘膦3个添加水平(0.05、0.5、1mg/L)的平均回收率(n=5)为98.2%～104.4%,5次测量的相对标准偏差为2.1%～3.6%,方法检出限为0.05mg/L。该方法灵敏、简便、快速,适合于农田沟渠水中草甘膦残留量的检测。     

拟南芥T1N6_22在抵抗Pst DC3000侵染过程中的功能分析

【目的】明确拟南芥抗灰霉病基因T1N6_22在抗Pst DC3000过程中的功能,分析T1N6_22影响拟南芥对Pst DC3000的抗性原因。【方法】对t1n6_22突变体和转基因回复突变体（t1n6_22/T1N6_22）接种Pst DC3000,检测其症状;采用间苯胺蓝染色法检测接种突变体中胼胝质的积累情况;测定接种叶片中Pst DC3000的生长量,明确T1N6_22在拟南芥抗Pst DC3000过程中的功能。利用RT-PCR技术,检测SA、JA和ET对T1N6_22表达的影响及T1N6_22对抗病防御相关基因表达的影响;利用quantitative real-time PCR技术,检测Pst DC3000对T1N6_22及抗病相关基因表达的影响,分析T1N6_22影响拟南芥对Pst DC3000的抗性原因。【结果】t1n6_22突变体接种Pst DC3000后表现明显的抗病症状,而回复突变体t1n6_22/T1N6_22和拟南芥野生型表现明显的感病症状。SA处理拟南芥野生型,T1N6_22的表达量明显增强,经JA和ACC处理,该基因的表达量无显著变化。t1n6_22突变体中,PAL、PR4、PPO、SOD和CAT的表达水平均明显高于野生型Col-0和转基因回复植株。接种Pst DC3000后,拟南芥野生型中T1N6_22及抗病相关基因PR1、PR3、PR5和PDF1.2的表达量明显增强。【结论】T1N6_22在拟南芥抗Pst DC3000过程中起负调控作用,T1N6_22的表达受SA诱导,可能主要通过调节植物的次生代谢产物的分泌影响拟南芥对Pst DC3000的抗性。     

枣果中多酚物质的体外活性研究

通过酒石酸铁法对枣果中多酚类物质的含量进行了测定,并利用化学发光分析法测定了枣果中多酚物质间苯三酚和邻苯二酚的体外抗氧化活性。结果表明:枣果中多酚类物质间苯三酚和邻苯二酚对·OH、NO2-具有较明显的抑制作用,为枣产品保健功能的开发利用提供了新的研究方向和理论基础。