玉米大斑病菌毒素结构的确定及几种类似物的毒性比较

 通过对玉米大斑病菌Ht-毒素组分1与标准5-羟甲基-2-呋喃甲醛核磁共振¹H谱比较,进一步明确了组分1的化学结构。用玉米离体叶浸渍法及离体根冠细胞致死生测法对Ht-毒素组分1、5-羟甲基-2-呋喃甲醛、呋喃甲醇、呋喃甲醛、呋喃甲酸进行毒性和致病活性比较,结果表明,Ht-毒素组1、标准样品及几种毒素类似物在供试浓度范围内对寄主玉米均有高度的生物毒性,其中以呋喃甲酸毒性最大。从TLC扫描光谱和色谱来看,5-羟甲基-2-呋喃甲醛确为Ht-毒素的一种主要毒性组分,而且该化合物在体内外随着不断氧化,生物毒性逐渐提高。     

应用IC-RT-PCR方法检测齿兰环斑病毒和建兰花叶病毒

根据已报道的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒外壳蛋白基因序列设计PCR引物,建立了蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒IC-RT-PCR检测方法。用该方法对天津地区8个蝴蝶兰标样检测,结果显示:8个标样中有4个检测到建兰花叶病毒,另外4个检测到齿兰环斑病毒。该方法简化了操作程序,为蝴蝶兰种苗病毒的快速检测奠定了基础。     

玉米大斑病菌HT-毒素对玉米细胞CAT酶活性的影响

HT-毒素可抑制玉米叶片细胞CAT酶活性。粗毒素(含组分Ⅳ)处理后,供试2个玉米自交系叶片细胞的CAT酶活性虽都受到抑制,但毒素处理6h时自交系Oh43Ht1受抑制极其明显;而此时用毒素组分I和标准毒素I处理后Oh43的相对酶活性又明显低于Oh43Ht1。即HT-毒素对不同Ht基因玉米叶片细胞CAT酶活性的抑制作用表现了一定的寄主选择活性。试验发现,标准毒素补加H₂O₂后,Oh43的CAT酶活性在12h内急剧上升(12h达最大值:11.0568mg/g·FW·min),之后又迅速下降;相反,Oh43Ht1的CAT酶活性却急剧下降(12h达最小值:1.7000mg/g·FW·min),之后活性上升,可见毒素处理早期,H₂O₂可刺激Oh43玉米细胞CAT酶的活性,却抑制Oh43Ht1玉米细胞CAT酶的活性。此外,玉米幼茎细胞受HT-毒素胁迫后,各处理的CAT酶活性基本类似,即活性早期下降,后期上升。     

不同基因型玉米受HT-毒素胁迫后细胞内CaM的动态变化

采用ELISA方法测定了亲和组合与非亲和组合玉米叶片内钙调素(Calmodulin,CaM)浓度的变化,旨在明确不同组合中CaM的变化趋势以及CaM是否参与玉米体内由大斑病菌HT-毒素所引发的信号转导途径。通过观察CaM特异性抑制剂三氟拉嗪(Trifluoperazine,TFP)对玉米叶片上HT-毒素诱导的R型病斑的影响,明确TFP是否可抑制玉米的抗病反应。结果发现,玉米受到HT-毒素胁迫后,叶片内CaM浓度迅速上升,总的趋势是亲和组合中的CaM曲线多呈平台状或单峰状,而非亲和组合中的CaM曲线多呈双峰状,在不同组合中CaM的变化差异显著;TFP可使叶片病斑由抗病的R型病斑转变为感病的S型病斑,说明TFP可抑制玉米的抗病反应。推测,由玉米大斑病菌HT-毒素激发的防卫反应信号转导途径与CaM密切相关。     

玉米大斑病菌菌丝蛋白电泳分析及抗体检测

 研究表明,玉米大斑病菌1号小种(原命名法为2号小种)产生的毒素对带有Ht1基因的玉米具有高度的致毒活性,且与0号小种(原命名法为1号小种)毒素的成分不同,1号小种毒素含有一种克服Ht1基因玉米的特异性毒性组分。     

玉米弯孢霉叶斑病菌的寄生适合度与RAPD分析

对采自河北省14个玉米产区的28个玉米弯孢霉叶斑病标样进行了分离鉴定,发现新月弯孢(Curvularialunata)占57.1%,棒状弯孢(C.clavata)占17.9%,画眉草弯孢(C.eragrostidis)占14.3%,中隔弯孢(C.inter-media)占10.7%。将4种玉米弯孢霉叶斑病菌接种在9个玉米自交系和杂交种上进行寄生适合度测定,发现新月弯孢和中隔弯孢的致病性最强,其次为棒状弯孢,画眉草弯孢的致病性最弱。用23条随机引物对28个菌株进行RAPD扩增,共获得了185个RAPD标记,其中多态性标记142个,多态性几率P=76.8%。利用菌株间的遗传相似性进行聚类分析,发现4种弯孢在种间存在的遗传差异可能是导致致病性差异的一个原因。在新月弯孢种内也存在较大的遗传差异,部分新月弯孢菌株与其它3种弯孢霉亲缘关系较近。     

玉米大斑病菌HT-毒素对玉米细胞膜透性的影响

玉米大斑病菌ＨＴ－毒素粗毒素、通过硅胶Ｇ柱层析获得的组分Ｉ、５－羟甲基－２－呋喃甲醛对玉米细胞膜都具有明显的损伤作用,且与毒素浓度和处理时间呈正相关。试验发现,来自２号小种的ＨＴ－粗毒素因含有组分ＩＶ、对ＯＨ４３Ｈｔ１玉米细胞膜的损伤要比组分Ｉ和５－羟甲基－２－呋喃甲醛强的多。ＨＴ－毒素中外源加入强氧化剂Ｈ２Ｏ２后,可提高毒素对细胞膜的破坏作用,尤其是５－羟甲基－２－呋喃甲醛加入Ｈ２Ｏ２后对叶片细胞膜的破坏作用更加明显。结论初步判断,ＨＴ－毒素的原初作用位点可能在感病玉米的细胞膜上。     

玉米大斑病菌黑色素缺失突变体的获得及其生物学特性

DHN黑色素是许多植物病原真菌的致病相关因子,为明确黑色素在玉米大斑病菌致病过程中的作用,采用三环唑和紫外线复合诱变的方法获得了黑色素缺失的6个突变菌株,对突变菌株的生长量、产孢量、HT-毒素活性、致病力进行测定。结果显示,突变菌株产毒能力变化不大,但生长量下降,产孢量和致病力显著下降或完全丧失,野生型菌株的产孢量和侵染频率分别是突变菌株的30～50倍和5倍。突变菌株与黑色素共培养后,菌株M01-23a和M01-23b恢复了致病力,但病斑面积和侵染频率较小。玉米大斑病菌黑色素与致病力具有一定的相关性。     

拟南芥PMRP基因在叶绿体淀粉粒积累和抗寒性中的作用

【目的】分析推测的膜蛋白（putitave membrane realated protein,PMRP）在拟南芥叶绿体发育过程的作用,明确PMRP对拟南芥光合能力的影响及抗寒性分析,为改善作物光合性能及增强抗逆性提供理论依据。【方法】构建PMRP的RNAi和过表达载体,转化农杆菌EHA105,采用花絮侵染法转化野生型拟南芥（Columbia,Col-0）,获得PMRP RNAi和过表达转基因拟南芥;以野生型和PMRP RNAi、过表达转基因拟南芥为材料,利用细胞生物学方法,观察PMRP表达量对拟南芥叶肉细胞叶绿体的结构和淀粉粒积累的影响;利用红外CO₂分析法测定拟南芥的光合速率,分析PMRP对拟南芥光合能力的影响。选取16 h光照、21℃条件下培养的21 d的野生型Col-0、3个过表达PMRP转基因拟南芥株系,3个PMRP-RNAi转基因拟南芥株系,用冷光源培养箱培养,先在4℃培养7 d,然后在-8℃培养1.5 h,取出放到16 h光照、21℃条件培养7 d后,分析PMRP转基因拟南芥对寒害的抗性。选取14 d的野生型Col-0、3个过表达PMRP转基因拟南芥株系和3个PMRP-RNAi转基因拟南芥株系,对其莲座叶细胞渗出液电导率进行测定。【结果】获得PMRP RNAi和过表达转基因拟南芥株系;通过测定野生型和转基因株系的莲座叶光合速率,野生型Col-0的光合速率为7.3 μmol·m^-2·s^-1,PMRP-RNAi转基因拟南芥的光合速率分别为8.8、7.8和8.5 μmol·m^-2·s^-1,PMRP表达量的降低略增强了拟南芥的光合速率。野生型Col-0的绿叶率为48%,过表达PMRP转基因拟南芥的3个株系绿叶率分别为48.6%、47.8%和49.2%,3个PMRP-RNAi转基因拟南芥的绿叶率分别为65.9%、67.4%和68.3%,表明PMRP表达量的降低增强了植物的耐寒性。在-8℃下处理30 min,野生型Col-0拟南芥莲座叶的渗出液电导率为70.67 μS·cm^-1,PMRP-RNAi拟南芥莲座叶渗出液电导率分别为48.57、45.40和52.10 μS·cm^-1。表明PMRP表达量的降低明显降低了逆境对细胞膜的损伤。通过对PMRP-RNAi转基因拟南芥和野生型拟南芥完全展开的莲座叶,进行超微结构分析,发现野生型拟南芥莲座叶细胞中,叶绿体为椭圆形,而PMRP-RNAi转基因拟南芥莲座叶细胞叶绿体变为近似圆形;在光照情况下,PMRP-RNAi转基因拟南芥叶绿体中淀粉粒的积累与野生型相似,均有明显的淀粉粒积累,但在黑暗环境中,PMRP-RNAi转基因拟南芥叶绿体中淀粉粒积累明显增多。【结论】PMRP表达量降低造成叶绿体形状由梭型变为圆球型,淀粉粒明显增多,增强了拟南芥的抗寒性。     

玉米大斑病菌StSLT2基因结构与表达模式分析

本研究利用生物信息学技术分析玉米大斑病菌StSLT2基因的结构特征,并利用RNA-Seq技术分析了StSLT2基因在不同发育时期的表达模式。研究发现玉米大斑病菌StSLT2基因DNA全长为5 842 bp,cDNA全长为3 105 bp,包含13个外显子和12个内含子,编码1 034个氨基酸;该蛋白包含S_TKc保守结构域,在该区域内包含1个典型的MAPK蛋白激活域(TEY);对该蛋白的系统发育分析表明,玉米大斑病菌与玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)和白菜黑斑病菌(Alternaria brassicicola)的SLT2基因之间的进化关系最近;对其表达模式分析发现,该基因在菌丝、分生孢子、芽管、附着胞、侵入钉等5个时期均有不同水平的表达,其中在分生孢子发育时期的表达量最高,在芽管形成时期表达水平最低。以上结果表明,该基因对玉米大斑病菌分生孢子的发育有重要的调控作用。该研究不仅明确了玉米大斑病菌StSLT2的结构及其表达模式,也为揭示其功能奠定了基础。