拟南芥茉莉酸信号途径突变体jar1的灰葡萄孢菌抗性分析

为研究拟南芥JAR1 (At2g46370)基因在灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)抗性反应中的作用,从拟南芥生物资源中心获得其功能下降突变体jar1 (SALK_030821)。以纯合突变体为材料,将灰葡萄孢菌的孢子悬浮液接种到4周龄的拟南芥叶片上,统计接种后一周内植株病情指数。通过实时荧光定量RT-PCR测定灰葡萄孢菌肌动蛋白基因(B. cinerea actin)在拟南芥叶片中的表达量,分析了病原物的繁殖情况。结果发现,从接种后的第2天开始,jar1植株的病情指数显著高于野生型。qRT-PCR检测结果表明,在接种后的第三天,野生型植株中B. cinerea actin的表达量是对照的6.9倍,而jar1植株中B. cinerea actin的表达量是对照的20.2倍,说明病原物在jar1突变体叶片上的繁殖速度显著高于在野生型中的。本研究的结果初步表明JAR1基因参与拟南芥对灰葡萄孢菌的抗性调控。     

灰葡萄孢致病力增强突变体BCt98的突变基因分析

为获得灰葡萄孢的致病相关基因并研究其基因功能,筛选灰葡萄孢的T-DNA插入突变体库,获得了一株致病力增强的突变体BCt98。利用PCR和Southern Blotting技术,对突变体BCt98进行鉴定。利用TAIL-PCR技术结合生物信息学方法,确定了突变体BCt98中T-DNA插入位点位于BC1G_07014.1基因的第3个外显子上。利用RT-PCR技术,确定了突变体BCt98的突变基因为BC1G_07014.1。突变体BCt98生长速度较快,菌落颜色较浅,菌丝较为致密,不产生分生孢子和菌核,且胞壁降解酶(PMG、PG和Cx)及毒素活性较野生型明显增强。表明BC1G_07014.1基因在灰葡萄孢生长、发育和致病力调控方面发挥重要作用,且参与调控病菌的胞壁降解酶活性和毒素活性。     

油菜黑胫病菌T-DNA插入致病力减弱突变体的筛选及侧翼序列分析

为揭示油菜黑胫病菌的致病分子机理,基于已建立的Leptosphaeria biglobosa突变体库,随机挑选16个突变体,对其致病力进行检测,筛选到12个致病力下降的突变体。并对其中6个致病力显著减弱突变体的菌落生长特性、生长速率、产孢量进行测定,结果显示,T1、T3、T4、T7突变体与野生型nm-1菌落形态相比没有明显差异,T9、T11与野生型nm-1相比,菌丝形态致密,没有产孢;T1、T3、T4、T7、T9突变体生长速率比野生型nm-1快,而T11显著低于野生型nm-1;6个突变体的产孢能力与野生型nm-1相比都显著下降;Southern Blot分析其T-DNA插入的拷贝数为单拷贝插入。并通过Hi TAIL-PCR技术扩增了6个突变体的右侧翼序列,经Blast比对分析,初步确定了T-DNA插入Leptosphaeria biglobosa基因组的位置,T-DNA插入的右侧翼序列可能为致病基因的部分序列,为进一步确定油菜黑胫病菌致病基因及其功能提供参考依据。     

Molecular Cloning and Preliminary Analysis of Clmk-1 Gene in Cochliobolus lunatus

谷子弯孢病菌(Cochliobolus lunatus)为谷子上重要的叶部病害,发生严重时会影响谷子的产量及品质.为了解MAPK级联途径在谷子弯孢病菌发育及致病性中的作用,根据已知植物病原真菌MAPK基因的保守结构域设计简并引物,通过PCR扩增法获得了谷子弯孢病菌MAPK基因的同源片段,并利用RACE技术获得了基因的全长cDNA 序列,该基因命名为Clmk-1.Clmk-1基因开放阅读框为1065bp,编码354个氨基酸,并且含有MAPK基因的保守的TGY和CD基序.聚类分析结果表明,谷子弯孢病菌Clmk-1基因与其他植物病原真菌Hog1类似MAPK基因的同源性很高.利用Promoterscan软件发现,Clmk-1基因启动子区含有热激转录因子(HSF)、ADR转录因子和GCR转录因子的结合元件.MAPK途径特异性抑制剂U0126抑制谷子弯孢的孢子萌发及芽管发育.研究初步表明,Clmk-1基因为Hog1类似MAPK基因,可能与渗透胁迫相关,并且MAPK级联途径参与病菌孢子萌发及芽管形态建成.克隆的Clmk-1基因为进一步研究谷子弯孢病菌MAPK基因的功能奠定基础.     

拟南芥swn突变体耐盐性的初步分析

SWN (Swinger)蛋白是多梳抑制复合体2 (polycomb repressive complex2, PRC2)结构的核心成分之一,为了研究SWN在拟南芥中耐盐胁迫方面的作用,我们分析了拟南芥突变体swn与野生型之间转录组水平的基因表达差异,高盐胁迫下的萌发实验,以及与盐胁迫响应基因RD20 (Responsive to desiccation 20)、SOS1 (Salt overly sensitive)和MAPK6 (Mitogen-activated protein kinase)的表达。结果显示,GO富集分析表达上调的基因,共富集到20个GO通路,其中响应盐胁迫通路(Respond to salt stress)富集程度较高;在高盐胁迫下,swn表现出比野生型更高的萌发率,幼苗生长情况也优于野生型;盐胁迫响应基因RD20、SOS1和MAPK6表达量也更高。本研究表明,swn突变体对盐的耐受性强于野生型,SWN基因在拟南芥抗盐过程中发挥负调控作用。     

尖孢镰刀菌亚麻专化型Folcdc15基因参与调控分生孢子发生和菌丝生长

通过对尖孢镰刀菌亚麻专化型Folcdc15基因敲除及敲除突变体互补试验，探究该基因在尖孢镰刀菌亚麻专化型中的功能。对Folcdc15基因进行DNA测序后，使用Split-Marker技术，构建含有潮霉素抗性基因(hph)缺失盒。通过PEG介导法转入野生型原生质体，在含有潮霉素的选择培养基上进行转化子筛选，通过PCR正负筛选确定敲除突变体。利用pZWH1载体构建含有Folcdc15的互补载体pZLY1,将其转入敲除突变体中进行互补测验。与野生型hm相比，敲除突变体ko1菌落生长速率下降了73%,菌丝形态发生了显著改变，菌丝变短且分叉变多，分生孢子隔膜数量增多长度增加，分生孢子数量显著减少。亚麻侵染试验表明，ko1的致病力显著降低。通过互补测验发现，回复突变株ca1恢复了Folcdc15基因缺失带来的分生孢子产量及形态、菌落生长和形态及致病力的缺陷。Folcdc15参与调控尖孢镰刀菌亚麻专化型的分生孢子发生及菌丝生长。     

禾谷镰孢菌FGSG＿09482基因功能初探

为研究禾谷镰孢菌FGSG09482基因的生物学功能,以禾谷镰孢菌为试材,采用Split-Marker基因敲除技术构建基因敲除盒,PEG (聚乙二醇)介导转化法转化禾谷镰孢菌原生质体,在含有潮霉素的培养基上培养筛选,获得FGSG09482基因敲除突变株。通过观察比较其敲除突变体表型,从而分析鉴定该基因的生物学功能。结果表明:以野生型PH-1作为对照,敲除突变体的菌落形态没有明显变化,分生孢子形态没有明显差异,培养滤液颜色没有明显区别。分生孢子侵染番茄果实实验表明,以番茄果实为侵染宿主,对比野生型PH-1,突变体致病力没有减弱。但突变体菌落的生长速率滞后于野生型PH-1;敲除突变体的产孢量低于野生型PH-1;有性杂交实验表明,敲除突变体几乎不产生子囊壳,野生型PH-1可以。本研究初步表明,FGSG09482基因对禾谷镰孢菌菌落的生长速率有一定的调控作用;对禾谷镰孢菌的分生孢子的产量、子囊壳的产生也有影响,推测FGSG09482基因可能与禾谷镰孢菌有性生殖、无性生殖过程相关。     

一个水稻黄叶突变体的叶绿素合成关键基因的表达分析

为了研究水稻黄叶突变基因与叶绿素合成途径的关系及突变基因的作用机理,本研究以野生型作对照,结合半定量与实时定量PCR技术,对突变体茎和叶组织中叶绿素合成关键基因的RNA表达水平进行了分析。结果显示,在茎组织中,研究选取的8个基因在突变体和野生型中的表达均没有明显差别。而在叶组织中,突变体的YGL1和CHLI两个基因的表达量约为野生型的1.8倍,表达明显上调;CHLD基因的表达量约为野生型的0.6倍,表达明显下调;其余5个基因的表达没有明显差别。研究表明,突变基因能够调控叶绿素合成关键基因YGL1、CHLD和CHLI的表达,从而影响叶组织中叶绿素的合成,这为进一步研究突变基因对叶绿素合成的调控模式及其作用机理奠定了基础。     

亚洲棉短绒突变体纤维发育及其差异基因表达分析

棉花纤维是重要的天然纺织材料,是最长的单细胞,是研究纤维发育的良好材料。本研究以亚洲棉短绒突变体(FZ)及其野生型(fz)为材料,结合扫描电镜、石蜡切片、RNA-seq技术,解析棉花短绒起始的可能机制。与野生型(fz)的0DPA时期胚珠相比,突变体的胚珠在该时期仅有少量的纤维起始。在+3DPA时,突变体没有短绒细胞起始,仅有长纤维细胞,而野生型有大量的短纤维细胞和长纤维细胞。对这2个材料的0DPA、+3DPA、+5DPA和+8DPA胚珠差异基因分析结果显示,在短绒突变体(FZ)和野生型(fz)的4个纤维发育时期共挖掘出3780个差异表达基因,其中0DPA时差异基因数目最少,随着胚珠发育时间的延长,差异基因的数目逐渐增加。KEGG分析发现这些基因主要参与蜡质、角质生物合成,以及苯丙烷代谢和植物信号传导过程。共表达趋势分析显示,在突变体+3DPA上调的差异基因中,参与离子结合、MAPK级联反应、氧化还原活性和转录调控的基因表达受到正影响(表达水平提高),造成突变体短绒纤维不能正常起始。这些结果描述了二倍体亚洲棉短绒起始的动态变化,可为进一步研究棉纤维发育提供参考。     

棉花黄萎病菌鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白基因VdOAZ的功能分析

【目的】明确棉花黄萎病菌中鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白(OAZ)基因(VdOAZ)的功能。【方法】以大丽轮枝菌野生型菌株V592的基因组DNA和cDNA为模板,对VdOAZ基因全长进行克隆并测序。构建针对VdOAZ基因的敲除载体和互补载体,通过农杆菌介导的遗传转化筛选VdOAZ基因敲除菌株和和互补菌株。以野生型菌株V592为对照,对VdOAZ基因敲除突变体和互补菌株的菌落生长速率、产孢量、微菌核产量及对棉花的致病力进行测定;通过实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应测定致病相关的其他基因在VdOAZ基因敲除突变体中的表达量,及亚精胺诱导条件下,V592菌株中VdOAZ基因及致病相关的其他基因的相对表达量。【结果】从棉花黄萎病菌中克隆到VdOAZ基因的全长为1 006 bp,具有2个开放阅读框(Open reading frame,ORF),ORF2编码的蛋白具有OAZ所特有的ODC-AZ保守结构域。与野生型菌株V592和互补菌株相比,VdOAZ基因敲除突变体的菌落生长速率降低、微菌核产量及产孢量明显减少,对棉花的致病力下降,表明VdOAZ基因与大丽轮枝菌分生孢子和微菌核的产生有关,并参与大丽轮枝菌致病。在VdOAZ基因敲除突变体中,VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2和VdSge1基因表达量显著上调;V592菌株经亚精胺诱导培养后,VdOAZ基因的表达量显著上调,而上述5个致病相关基因的表达量均明显下调,表明VdOAZ基因对其表达具有负调控作用。【结论】VdOAZ基因响应多胺水平改变,通过调控VdPKAC1、VMK1、VdNLP1、VdNLP2、VdSge1的表达影响大丽轮枝菌孢子产生、微菌核形成和致病过程。     

一个 T-DNA 插入突变体的分子鉴定及表达分析

突变体在水稻功能基因组研究中具有重要的作用。对水稻OsFCA位点的插入突变体进行了分子鉴定,证实此突变体为纯合突变体,并且发现突变体与野生型植株相比,抽穗期明显延迟。通过RT-PCR结果分析表明, T-DNA插入的突变体植株中OsFCA基因完全不表达。另外,在短日照条件下,对水稻成花相关的2个重要基因Hd1和Hd3a的RT-PCR分析表明,在野生型植株中,2个基因的表达量都明显高于突变体植株,尤其是在夜间的表达量相差较为明显。说明OsFCA在短日照条件下通过正向调控Hd1和Hd3a的表达促进水稻的开花。     

漾濞大泡核桃JsWRKY1过表达增强转基因烟草对胶孢炭疽菌的抗性

为进一步研究JsWRKY1的生物学功能,构建JsWRKY1的植物超表达载体并转入烟草中过表达。再生的JsWRKY1转基因烟草与野生型烟草在表型上无明显差异。JsWRKY1过表达上调了转基因烟草体内几个防卫相关基因MnSOD、Cu/Zn SOD、CN、NADPH oxidase和PR1的转录水平。与野生型烟草相比,JsWRKY1转基因烟草体内的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶活性在正常生长以及胶孢炭疽菌接种后均显著增强。平板抑菌试验结果显示,JsWRKY1转基因烟草叶片总蛋白对病原真菌葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌的菌丝生长具有不同程度的抑制作用。此外,用胶孢炭疽菌接种烟草叶片,转基因烟草对胶孢炭疽菌的抗性明显增强。显然,JsWRKY1是漾濞大泡核桃中正调控病害防卫反应的转录因子。     

棉花黄萎病菌VdSge1基因的敲除与功能分析

为了明确棉花黄萎病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)的VdSge1基因功能,本研究利用基因同源重组原理,通过构建敲除载体,对棉花黄萎病菌落叶型强致病力菌株V592的VdSge1基因进行了敲除,获得了4个目标基因敲除的突变体;以野生型菌株V592为对照,通过对敲除突变体生物学性状和致病性测定,结果表明,突变体的菌落生长速度、产孢量明显高于野生型,并且丧失对棉花的致病性。利用q RT-PCR对其他基因在突变体中的表达情况进行分析,结果表明,VdSge1基因敲除后,VMK1、VGB和VdGARP1的表达量随之下降,而VDH1和PevD1的表达却明显上升。由此说明,VdSge1基因与大丽轮枝菌的菌落生长速度、产孢量及致病性密切相关,并且可以影响其他一些基因的表达。     

稻瘟病原菌对水稻突变体ospfa-dsp2生长及抗氧化酶活性的影响

蛋白酪氨酸磷酸酶在植物的生长发育和胁迫应答过程中发挥着重要的功能,已有的报道表明Os PFA-DSP2是一个蛋白酪氨酸磷酸酶,在稻温病原菌的应答过程中发挥负调控作用。为了研究稻温病菌(Z1菌株)对突变体ospfa-dsp2生长和抗氧化酶活性的影响,试验以水稻为材料,利用分光光度计测定抗氧化酶活性、抗坏血酸和谷胱甘肽的含量,利用荧光定量PCR仪检测抗病基因的表达水平。试验结果显示,稻瘟病原菌对野生型日本晴水稻和ospfa-dsp2突变体的生长无显著性影响,但可以提高体内抗病基因的表达水平;稻瘟病原菌可以提高ospfa-dsp2突变体叶片中POD和SOD活性水平,降低抗坏血酸的含量,说明Os PFA-DSP2缺失后可以提高植株对稻温病菌的抗性。     

灰葡萄孢产孢缺陷菌株的遗传分析

本研究从400余株灰葡萄孢ATMT转化子中筛选到产孢缺陷菌株BCG-183.利用CTAB法提取野生型和BCG-183的基因组DNA,Southern杂交证实T-DNA标记在突变菌株中为单拷贝插入;对该菌株表型进行分析,发现BCG-183菌株菌落呈白色,菌丝产量较野生型大;致病性较野生型强;利用血球计数板计算产孢量,表明...     

拟南芥PUB10和PUB11基因抵抗丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3000株的功能分析

丁香假单胞杆菌Pseudomonas syringae pv tomato(Pst)DC3000是研究植物免疫机制的常用病原菌。为分析拟南芥E3泛素连接酶PUB10、PUB11在免疫中的功能,本研究构建了pub10/pub11双突变体。在分析拟南芥PUB10、PUB11序列相似性和进化关系的基础上,比较了pub10/pub11双突变体和Col-0对Pst DC3000的敏感性、MAPK磷酸化水平、ROS产生的影响,并检测JA信号响应途径和免疫防御相关的部分代表性基因的表达量。结果表明PUB10、PUB11氨基酸序列高度保守,pub10/pub11双突变体对Pst DC3000的侵染更敏感,侵染后叶片病原菌数目明显增多,MAPK磷酸化水平迅速下降,ROS释放量降低,JA信号响应基因(LOX3,JR2)、免疫防御负调控基因(NIMIN1,WRKY38,WRKY62,RIN4)表达量上升显著高于Col-0,而免疫防御正调控基因(AZI1,EDS1,PAD4,EDS5,FMO1,NPR1)表达量显著低于Col-0。由此推断,AtPUB10、AtPUB11在防御Pst DC3000中起正调控作用,并且存在功能冗余。研究结果为进一步探索PUB10、PUB11调控植物防御的分子作用机制和分子育种提供了依据。     

含异位表达花生AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力

AhNCED1是干旱胁迫下调控花生ABA生物合成的关键基因。以pCAMBIA1301为基本双元表达载体,分别构建CaMV35S启动子和拟南芥AtNCED3基因启动子(AtNCED3p)驱动花生AhNCED1基因的2个植物双元表达载体p35S::ORF和pAtNCED3p::ORF,通过根癌农杆菌介导法将上述两个表达载体分别转化野生型和129B08/nced3突变体拟南芥,经潮霉素筛选和PCR鉴定分别获得35S::ORF-WT和A3p::ORF-B08转基因植株,RT-PCR证实花生AhNCED1基因已在转基因植株中稳定表达,并对野生型、129B08/nced3突变体和转基因拟南芥进行外源ABA敏感性和耐渗透胁迫能力分析。结果表明,129B08/nced3突变体对外源ABA的敏感性下降,而花生AhNCED1基因在拟南芥中的异位表达提高了对外源ABA的敏感性。在山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体种子的相对萌发率明显低于野生型的,而A3p::ORF-B08转基因拟南芥种子的相对萌发率与野生型的相当,显著高于129B08/nced3突变体的,且300mmolL–1山梨醇胁迫下,35S::ORF-WT转基因拟南芥种子的相对萌发率明显高于野生型的。在300mmolL–1山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体幼苗叶片高度黄化,根的形成和幼苗生长受到严重抑制,而A3p::ORF-B08转基因突变体与野生型相似,叶片仅轻度黄化,幼苗生长势良好;35S::ORF-WT转基因植株幼苗生长未受明显影响。这些结果说明,拟南芥129B08/nced3突变体对山梨醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性,异位表达花生AhNCED1基因能恢复该突变体对山梨醇的超敏性,提高拟南芥的耐渗透胁迫能力。     

拟南芥G蛋白α亚基GPA1互作蛋白铜离子结合蛋白AtBCB的鉴定及功能分析

拟南芥G蛋白复合体(异源三聚体包括α、β、γ亚基)参与植物多个信号转导途径,G蛋白复合体通过膜上的G蛋白偶联受体(GPCR)接受胞外信号后通过3个亚基将信号传递给下游效应器。目前,有关植物G蛋白复合体的效应器及其信号传递途径的报道较少,寻找新的G蛋白的效应器有助于阐明G蛋白复合体相关的信号传导途径。本研究以拟南芥G蛋白α亚基GPA1为诱饵蛋白,利用泛素分离系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与GPA1互作的铜离子结合蛋白AtBCB。荧光双分子杂交(BiFC)试验证明,GPA1与AtBCB的互作发生在细胞膜上。基因表达特性分析结果显示,GPA1和AtBCB受金属铝胁迫的诱导表达。进一步以野生型拟南芥(WT)、GPA1拟南芥突变体gpa1-4和AtBCB拟南芥突变体bcb为材料,研究该基因对植物耐金属铝胁迫的功能,结果显示,在无胁迫情况下,2个突变体和WT根部的丙二醛含量无显著差异;在100 µmol L^–1 Al³⁺处理下,gpa1-4突变体根部丙二醛含量显著(P<0.05)低于WT低;bcb根部丙二醛含量极显著(P<0.01)高于WT。对3个铝胁迫响应基因(苹果酸转运体基因AtALMT1、半类型ABC转运蛋白基因ALS1和ABC转运蛋白基因ALS3)的表达进行Real-time PCR分析,比较它们在突变体和野生型之间的表达差异,发现在有铝和无铝处理情况下,ALS1和ALS3的表达水平在突变体和WT间均无显著差异;在铝处理下,gpa1-4中AtALMT1的表达量极显著高于WT;在bcb中的表达量显著低于WT。以上结果表明,植物通过细胞膜上的G蛋白α亚基GPA1和铜离子结合蛋白AtBCB的相互作用调控下游基因AtALMT1的表达,参与植物对铝胁迫的响应,其中GPA1对铝胁迫耐受起负向作用,AtBCB对铝胁迫耐受起正向作用。     

OsNAC2d基因编辑水稻突变体的创建及其对干旱胁迫的响应

为探究转录因子OsNAC2d的生物学功能及其对水稻耐旱性的影响,本研究利用CRISPR/Cas9编辑技术对粳稻中花11中的OsNAC2d基因进行突变,并考察osnac2d突变体在田间种植下的农艺性状,以及突变体幼苗在干旱胁迫下的生长情况和OsNAC2d基因表达水平。结果表明, OsNAC2d基因主要在水稻成熟籽粒、叶片和花药中表达,在根系和茎中的表达量较低,并且受干旱胁迫诱导,在10株阳性OsNAC2d基因突变株系的T2代植株中,筛选出6种纯合osnac2d突变体,田间试验调查表明,osnac2d突变体与野生型中花11相比,株高、有效穗、穗长、穗粒数、结实率、千粒重和单株产量等农艺性状无显著差异。在干旱胁迫时, osnac2d突变体幼苗的根系与植株生长、根系和地上部生物量的积累均受到抑制,且OsNAC2d在osnac2d突变体中的表达量维持在较低水平,而野生型水稻的OsNAC2d表达则受干旱胁迫诱导而增强,植株生长与生物量积累未受到显著抑制,表明转录因子OsNAC2d正调控水稻响应干旱胁迫。创建的osnac2d突变体材料为进一步揭示OsNAC2d的生物学功能及其响应干旱胁迫的精细调控机...     

野生大豆碳酸盐胁迫应答基因GsMIPS2的克隆及功能分析

为挖掘野生大豆(Glycine soja L.G07256)耐碳酸盐关键功能基因,利用前期高通量转录组测序数据,从构建的碳酸盐胁迫基因表达谱中,选取了一个碳酸盐胁迫下显著上调表达的肌醇-1-磷酸合酶类基因。采用同源克隆的方法,获得该基因的全长cDNA,命名为GsMIPS2。实时荧光定量PCR结果显示该基因受碳酸盐胁迫诱导表达,并且其表达量具有组织特异性。将GsMIPS2基因转化拟南芥,并结合拟南芥中T-DNA插入突变体atmips2来验证其耐碳酸盐功能。结果表明,碳酸盐胁迫条件下,GsMIPS2超量表达拟南芥种子萌发率显著高于野生型,而拟南芥突变体atmips2种子萌发率显著低于野生型。上述结果表明,GsMIPS2基因在植物应答碳酸盐胁迫过程中起重要作用。