欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立

为了构建猪流感病毒A/swine/Tian Jin/6/2013(H1N1)的反向遗传操作技术平台,通过RT-PCR技术分别扩增了欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的8个基因片段,并分别连接至双向转录表达载体p BD上。纯化8个重组质粒,共转染到293T细胞。54 h后收集上清,并接种到MDCK细胞。待细胞病变明显时,进行血凝试验检测收集到的上清,测得血凝效价为1∶32。测定拯救病毒的全基因组序列,结果显示,在核苷酸序列上,拯救病毒与野生病毒完全一致。细胞病变情况显示,拯救毒株与野生毒株无明显差别。本研究成功拯救了欧洲类禽H1 N1亚型猪流感病毒,为猪流感病毒的致病机理、基因功能研究以及H1N1亚型猪流感病毒新型疫苗的研发奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪外周血CD4、CD8分子动态变化研究

研究利用流式细胞仪对猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）后不同时期的CD4和CD8分子动态变化进行分析。结果表明：猪感染PRRSV后的第3天,CD4^＋和CD8^＋的数量开始急剧下降,在第12天达到最低水平;以后逐渐升高,CD4^＋的数量到第26天赶上并超过感染前的水平,在第33天又有所下降;而CD8^＋的数量在第19天就升高到感染前的水平。     

乙型脑炎病毒结构蛋白基因的克隆表达与免疫特性分析

研究分别克隆了乙型脑炎病毒SA14-14-2株的结构蛋白C、PrM/M及E蛋白基因.将3个结构蛋白基因分别插入表达质粒pET30(a)中,成功构建3个原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后利用IPGT诱导,SDS-PAGE分析结果表明,3个结构蛋白获得了表达,表达产物大小与预期一致.Western-blot分析结果表明:表达产物中PrM/M和E蛋白具有很好的免疫反应性,可被抗乙型脑炎病毒血清很好地识别;而C蛋白的免疫反应性较差,不能很好地被乙型脑炎病毒阳性血清识别.该结果提示,乙型脑炎病毒结构蛋白中除E蛋白外PrM/M蛋白也很可能具有诊断抗原的应用潜能.     

传染性喉气管炎病毒WG株糖蛋白gJ基因的克隆与表达

根据GenBank中已发表的传染性喉气管炎病毒全基因组序列（NC006233）设计引物,以传染性喉气管炎病毒WG株基因组为模板,PCR扩增糖蛋白gJ基因,并对其进行序列分析。用DNAStar软件分析酣蛋白的抗原性,选择抗原性强的140aa-483aa片段,克隆并连接到原核表达载体pET-32a（＋）中,转化BL21（DE3）菌株。经IPTG诱导后,获得大小为65．2ku的重组蛋白,命名为卜出,表达量占菌体蛋白总量的60．8％;Westernblot分析表明r-gJ具有较强的抗原性。     

分子佐剂C3d增强猪流感病毒HA-DNA疫苗免疫原性的研究

为了探讨分子佐剂C3d对猪流感病毒HA-DNA疫苗免疫原性的影响,本研究构建了3种表达不同形式HA的重组质粒,分别为:表达分泌型HA的质粒p-sHA、表达全长HA的质粒P-tmHA和融合表达3拷贝鼠C3d与HA的质粒P-sHA/mC3d3.3种质粒与空载体pCAGGS分别免疫BALB/c小鼠后,采用ELISA和HI试验检测抗体水平.结果显示,免疫后第8周,P-sHA组与P-tmHA组的抗体水平没有明显差别,而P-sHA/mC3d3免疫组的抗体水平显著高于这两组,说明分子佐剂C3d增强了抗体应答水平.淋巴细胞增殖试验及细胞因子检测实验结果显示,免疫后第8周,P-tmHA诱导了更强的淋巴细胞增殖反应和更高水平的IFN-,而p-sHA/mC3d3诱导了更高水平的IL-4,说明HA表达形式的变化影响了免疫反应的类型,C3d与HA融合后通过诱导IL-4的产生而使免疫反应倾向于Th2型.总之,本研究证实3拷贝分子佐剂C3d与分泌型HA融合后显著提高了DNA疫苗诱导的抗体水平.这提示质粒P-sHA/mC3d3免疫可能对接种动物提供高水平的保护,有希望成为抗猪流感病毒的候选疫苗.     

病毒感染的抗体依赖性增强作用及其机制

病毒感染都是从黏附于细胞表面开始的,黏附是通过病毒表面蛋白与靶细胞上特异性受体和配体分子的相互作用来完成的.病毒表面蛋白的特异性抗体常常可以阻抑这一步骤,将病毒"中和",使其失去感染细胞的能力.     

猪伪狂犬病毒变异毒株的特性及其疫苗的研究现状

正猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的高死亡率的急性传染病。该病在我国发生较为严重,是严重危害我国养猪业的疫病之一。我国于20世纪70年代从匈牙利引进了伪狂犬疫苗Bartha-k61株,自20世纪90年代以来国内规模化猪场普遍使用该基因缺失疫苗,使猪伪狂犬病得到了很好的控制。但是,自2011年以来,一种由伪狂犬病毒变异毒株引     

禽流感发生的流行病

今年以来，国外高致病性禽流感疫情呈明显扩大态势，特别是进入秋冬季以后，候鸟向南迁徙，家禽调运频繁，极易造成疫情传人和爆发。禽流感虽然没有像2003年的SARS疫情那样明显地影响和改变我们的生活，但接连由动物引发的威胁到人类健康甚至生存的疫情，还是让人产生很多的联想和思索。微生物远在人类出现之前就存在于这个星球上了，也将伴随着人类生命的进化而进化，或许它在人类生命消失之后还会存在于这个星球。而由于微生物对环境的适应力极强，它不会像动物或者植物那样出现某个种类的灭绝，科学的发展，也只能是尽力控制病毒。流感病毒也是如此。禽流感的发生和流行有其必然的因素。今年导致禽流感流行传染的原因除了周边国家发生禽流感以外，主要如下：对禽粪检疫力度不够或缺少主动监测；候鸟迂徙导致疫情蔓延；人畜禽间保持密切接触等。农业部对全国部分地区发生的禽流感疫情高度重视，特别派国家动物流行病学研究中心专家赴疫区，协助开展流行病学调查和疫情追踪工作。总结禽流感的发生与流行，希望能对禽流感的防制提供参考。     

暴发高致病禽流感疫区鸟类禽流感的血清学调查

本研究应用血凝抑制试验(H I),2004年初H 5亚型禽流感在中国内地发生前后,于湖北、广西二疫区市县的生态系中,自健康的鹰、鸽子、野鸭和鹌鹑中采集了54份血清,对其进行了血清学检测,并将获得的血清学检测数据进行了统计学分析。分析结果显示,在总共采集的54份血清样品中,抗H 6亚型禽流感病毒(H 6)抗体、抗H 9亚型禽流感病毒(H 9)抗体、抗H 5亚型禽流感病毒(H 5)抗体阳性率分别为64.8%、75.9%、29.6%。推断,这一时期,H 6亚型禽流感病毒(H 6)、H 9亚型禽流感病毒(H 9)和H 5亚型禽流感病毒(H 5)共循环于该生态系中,其中H 9、H 6亚型禽流感病毒长期、稳定循环于该生态系中,为该生态系禽流感主要流行血清型。血凝抑制试验检测结果发现,H 5亚型禽流感病毒抗体滴度较低,最高仅为640×,其阳性率为29.6%,推断其可能为新近传入的病毒或新近重组变异出现的新病毒,可能为与该次禽流感暴发相关的新病毒,这一推断还有待于通过对病毒基因序列的分析而做进一步验证。     

应用竞争PCR定量检测猪IFN—γ mRNA

运用RT—PCR从经ConA体外刺激培养的猪外周血单核细胞(PBMC)提取的细胞总RNA中扩增猪γ—干扰素(IFN—γ)的部分片段，经酶切鉴定后双酶切缺失中间一小片段，将余下的2个较大片段连接，并用相同的引物在相同条件下扩增连接产物，从而获得截短的同源性片段。将其纯化后克隆于pMDl8—T载体，重组质粒经酶切和PCR鉴定后进行序列测定，验证无误后作为竞争性模板内对照，一定比例稀释后分别与等体积经刺激培养的PBMC总RNA反转录产物进行PCR，产物电泳后经扫描分析获得各目标条带与竞争条带的溴化乙锭(EB)嵌入光密度值(IOD)，经校正后取上述两者比值的对数值作为Y轴，取已知竞争模板相应浓度的对数值作为X轴，绘制成竞争曲线。应用建立的竞争PCR对不同样品重复试验表明，本方法操作简单，结果可靠，稳定性高，适用于猪IFN—γ mRNA的定量检测。