猪流行性腹泻病毒M基因的表达及鉴定

为了更好的研究近两年在我国爆发的猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)疫情,本实验室收集不同发病地区的临床样品进行猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea,PEDV)RT-PCR检测,并挑选8个阳性样品对其M基因进行扩增,克隆和测序。序列比对的结果显示,8个分离株与14个参考株之间的核苷酸以及氨基酸同源性分别是96.5%～99.9%和96.0%～100%,表明目前流行的PEDV其M基因是相对保守的。同时,我们将ZZ-1株的M基因克隆于原核载体pGEX-6p-1,转入菌株BL21中后获得了大量表达,重组蛋白大小约为50 kDa。利用PEDV阳性猪血清对纯化后的重组M蛋白进行Western blot分析,结果表明重组表达的M蛋白与临床阳性猪血清具有良好的免疫反应性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF4/ORF5基因区间的反向遗传操作:插入外源序列特性研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF4/ORF5基因间隔区有10个核苷酸(nucleotide,nt),为了探索ORF4/ORF5基因间隔区作为外源基因插入靶点的可行性,本研究通过突变PCR技术,获得一系列ORF4/ORF5间在不同位置插入不同碱基数及特定序列的突变体,随后进行了病毒拯救和复制分析。结果表明,在ORF4/5的10 nts间隔序列之前至少可插入13 nts;在间隔序列之后只能允许3 nts的插入;间隔序列之间能允许至少18 nts的插入,但允许插入的序列具有特异性,由此,暗示ORF4/5允许插入的外源序列与插入位置有关。本研究获得的诸多突变病毒为进一步研制PRRSV基因标识疫苗奠定了基础。     

中国大陆猪流感病毒流行特征及未来值得关注的几个问题

控制猪流感病毒（Swineinfluenzavirus,SIV）的流行具有重要的兽医学和公共卫生学意义。中国被认为是国际流感病毒的流行中心,对流感病毒的流行生态有着重要影响。本文将对中国大陆SIV流行特征做一归纳,并简要分析未来值得关注的几个问题。     

快速检测A型流感病毒的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法的建立

根据A型流感病毒基质蛋白（matrix protein,M）基因保守序列设计并合成特异性引物和TaqMan BHQ探针,建立快速检测A型流感病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆A型流感病毒M基因靶序列并将其连入pMD-18T载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.998。检测结果显示,该方法的灵敏度可达10 copies/μL或1 EID50病毒且特异性良好,除A型流感病毒外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪输血传播病毒检测结果均为阴性。该方法重复性好,批内和批间变异系数均小于3%。对40份实验感染样品的检测结果表明,该方法与病毒分离结果一致,比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高,特异性更强。     

中国流行的2009甲型H1N1猪源流感病毒HA和NA基因的分子和遗传特征

目前流行的甲型H1N1流感病毒是一个复杂的基因重配病毒。对病毒的分子生物学研究,尤其是病毒囊膜蛋白血凝素（haemagglutini,HA）基因和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因的研究,为控制和预防H1N1流感病毒具有重要的意义。本研究对中国流行的2009甲型H1N1猪源流感病毒的HA和NA基因与疫苗株A/California/07/2009（H1N1）,以及不同国家和地区的病毒株进行核苷酸和氨基酸序列分析。从NCBI的GenBank数据库下载所需要毒株的序列,采用Lasergene 6.0软件包中的EditSeq和MegAlign进行序列分析,进化树分析采用MEGA4.1软件。进化分析表明,中国流行的2009 H1N1流感病毒与疫苗株的核苷酸同源率分别在98.8%~99.7%和98.6%~99.6%之间;裂解位点处为I/VPSIQSR↓G,不具备高致病性流感病毒的特征;有1株NA抗性病毒。尽管与疫苗株相比,中国流行株2009甲型H1N1猪源流感病毒的HA和NA基因有部分突变,但这些突变并不是重要的。本研究首次详细分析了中国流行的2009甲型H1N1猪源流感病毒株与疫苗株的HA和NA基因的分子特征,对实时监测流感病毒HA和NA基因的变化具有重要意义。     

伪狂犬病弱毒疫苗与野毒株PCR鉴别诊断方法的建立

目前，在国内用于预防猪伪狂犬病的疫苗主要是基因缺失的弱毒（Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１）为了有效地地区弱毒免疫猪和野毒感染猪，本实验分别建立了一种通用和一种鉴别ＰＣＲ诊断方法，根据已发表的伪狂犬病病毒（ＰｒＶ）ｇＢ，ｇＥ基因的序列，设计并合成了两对引物：ＰＢ１／ＰＢ２和ＰＥ１／ＰＥ２，以疫苗株Ｂａｒｔｈａｋ－６１及野毒株Ｓ，Ｓｕ，Ｆ，Ｌ，Ｙ及闽Ａ（Ｍｉｎ－Ａ）ＤＮＡ为模板进行了ＰＣＲ扩增，结果显示用引物Ｐ     

猪生殖—呼吸道综合征病毒（PRRSV）CH—1a株N基因的分子克隆,？…

根据已发表的ＰＲＲＳＶＩＡＦ－ｅｘｐ９１株的核酸序列，设计了一对特异性引物，用ＲＴ－ＰＣＲ扩增了ＰＲＲＳＶＣＨ－１ａ株的Ｎ基因，经补平和磷酸化后，克隆到ｐＵＣ１８ＳｍａＩ位点上，经电泳分析，酶切和ＰＣＲ鉴定证实后，进行序列测定，序列分析表明ＣＨ－１ａ株与ＩＡＦ－ｅｘｐ９１株（美洲型）Ｎ基因核苷酸同一性为９３．２％，氨基酸同一性高达９６．７％，而与ＬＶ株（欧洲株）核苷酸同一性为６３％，氨基酸同一性仅     

鹅源H5N1亚型禽流感病毒新疆分离株A/Goose/XJYL/10/2003HA基因的克隆和序列测定与分析

根据已发表的H5N1亚型禽流感病毒的HA基因全序列,设计了1对引物,对禽流感病毒新疆株A/Goose/XJYL/10/2003(H5N1)提取RNA,经RT-PCR扩增后将其克隆到pMD18-T载体上,获得长为1758bp的HA全基因序列。序列测定后,分析结果表明,本试验株与广东、香港和东南亚等不同地区的H5N1禽流感病毒HA的核甘酸序列的同源率很高,其氨基酸切割位点附近具有高致病性禽流感病毒的特征。系统进化树分析表明,新疆株为独立分支,属于欧亚种系。     

爆发高致病禽流感疫区的自主活动鸟类 禽流感及新城疫的血清学调查与分析

应用血凝抑制试验（HI），时采自健康的鹰、鸽子、野鸭和鹌鹑中的54份血清血清学检测，分析结果显示。在总共采集的54份血清样品中，抗新城疫病毒（NDV）抗体流行血清型（seroprevalence）与抗H6亚型禽流感病毒（H6）抗体、抗H9亚型禽流感病毒（H9）、抗H5亚型禽流感病毒（H5）抗体阳性率分别为64．8％、75．9％、29．6％。而根据血凝抑制试验检测结果发现。H5亚型禽流感病毒抗体滴度较低，最高位为320，其阳性率为29．6％，推断其可能为新近传入的病毒或新近重组变异出现的新病毒，可能为与该次流感爆发相关的新病毒，这一推断还有待于通过对病毒基因序列的分析而做进一步验证；新城疫病毒在该生态系中的稳定循环．构成了对家禽潜在的威胁，我国目前非典型新城疫的一个主要原因是带毒鸟类的传入。     

水疱性口炎病毒糖蛋白基因的克隆和表达

对一株实验室保存多年的水疱性口炎病毒(VSV)的囊膜糖蛋白(VSV_G)基因进行了克隆和测序,并且构建了重组VSV_G真核系统表达载体。结果表明克隆的VSV_G基因全长1536个核苷酸(nt),其编码的G蛋白长为511个氨基酸(aa),氨基酸序列与20个Indiana血清型VSV毒株的同源性在95.4%左右(94.1%～98.0%)。种系发生树分析表明此病毒株属于水疱病毒属的VSV_Indiana血清型。经免疫荧光检测证明构建的重组VSV_G表达质粒pCIVG5和pCRVG6转染23T细胞后能够有效地转录和表达,这为进一步开发利用VSV_G奠定了基础。