鸭呼肠孤病毒基因Ⅰ型与Ⅱ型鉴别诊断RT-PCR方法的建立与应用

临床发病鸭(Anas platyrhynchos domestica)群中存在两种基因型鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)的感染.为建立一种能鉴别诊断DRV Ⅰ型(classical DRV,C-DRV)与Ⅱ型(novel DRV,N-DRV)的一步法RT-PCR检测方法,本研究通过对GenBank已公布的现有C-DRV和N-DRV S1和S4基因片段序列进行比对分析,设计合成两对特异性引物,并对引物浓度、退火温度和循环次数等扩增条件进行优化,建立一种能鉴别诊断C-DRV和N-DRV的一步法RT-PCR检测方法.结果表明,一步法RT-PCR最佳的反应体系为:PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1μL,2×1 Step Buffer 12.5μL,RNA模板1.5μμL,上下游引物(20μmol/L)各1μL,RNase Free dH2O补足25 μL;最佳反应条件:50℃反转录30 min;94℃预变性2 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30个循环.该方法可从C-DRV和N-DRV基因组中扩增出大小分别为249和505 bp单一特异性片段,从两种病毒基因组混合物中可同时扩增出两条特异性片段,而对鸭源常见病毒及正常细胞基因组在同等条件下检测均为阴性;该方法具有较高的敏感性,其最低病毒检出量分别为0.47和0.62个半数组织培养感染剂量(50％ tissue culture infective dose,TCID50);对不同代次、不同时间提取的病毒RNA样品重复检验3次,结果均一致.对浙江省2011～2015年采集的239份疑似临床病料进行检测,C-DRV与N-DRV的阳性率分别为2.5％(6/239)和31.4％(75/239);通过对阳性病料P10和P18扩增序列的测序也证实检测结果的准确性.本研究建立的双重一步法RT-PCR可以有效区分两种基因型DRV,且临床样品检测表明N-DRV是浙江省流行的优势基因型.本研究为鉴别诊断C-DRV与N-DRV提供了一个快速、灵敏性高及低成本的实验室诊断方法,该方法的建立可为DRV的分子流行病毒学调查提供有效的技术支持.     

鸡产蛋下降综合症病毒的分离和鉴定

鸡产蛋下降综合症(Egg Drop Syn-drome—1976,EDS_(76))是产蛋鸡的一种以产蛋下降、蛋品质降低、蛋壳畸形为主要特征的病毒性传染病。自1976年荷兰的 Van Eck等首次报道至今,许多国家和地区都先后发现了本病。近几年来,国内也有发生本病的报道。1992年,浙江省某县产蛋鸡群普遍暴发一种以发病率高、产蛋率大幅度下降、蛋质低劣的疫病,我们自该县某鸡群采集了病料,经鸭胚传代分离到一株病毒,试验证明其是与EDS_(76)AV—127株病毒极为相似的腺病毒。     

西藏林芝地区土壤水分特征曲线适用性研究

西藏地区自然气候特征、成土母质和成土条件有着显著的地区特性,了解西藏高原地区土壤水动力学特性对于研究高原地区水文和水循环过程具有重要的意义。2015年分别在林芝地区米林县(海拔2 905 m),八一镇(海拔3 240 m)和林芝县(海拔3 879 m)3个青稞种植区田间取样,在原状土土壤水分特征曲线测试的基础上,研究了西藏林芝地区土壤基质势和土壤含水率之间的关系,并建立了参数的微分求解方程,发展了土壤水分特征曲线非线性函数的参数估计方法;基于实测值构建Jacobi矩阵,采用全局性最优方法确定了van Genuchten模型和Gardner-Russo模型的参数。结果表明,-11.0~-4.0、-42.0~-11.0 k Pa以及-54.0~-42.0 k Pa基质势区段的单位基质势平均含水率变化量分别为5.4×10-3、11.2×10-3和6.7×10-3cm~3/(cm~3·k Pa),最大差异性发生在-54.0~-42.0 k Pa之间,西藏地区的土壤水分特征曲线形状主要决定于黏粒质量分数,而砂粒质量分数则主要影响土壤水分特征曲线的变异性。van Genuchten模型和模拟6组试验数据的相对误差平均值和最大值分别为0.04和0.09。采用Gardner-Russo模型模拟6组试验数据的相对误差的平均值和最大值分别为0.06和0.14。van Genuchten模型模拟西藏林芝地区的土壤水分特征曲线的精度及有效性显著超过Gardner-Russo模型。     

缺失gE基因的牛Ⅰ型疱疹病毒构建及其体外增殖特性比较

为构建gE基因缺失的牛Ⅰ型疱疹病毒(BHV1),本研究在BHV1全基因组感染性细菌人工染色体克隆pBHV1-ZJ的基础上,利用Red E/T重组技术,分别构建了gE基因缺失、gE和gN双基因缺失的pBHV1突变体,通过转染获得了重组病毒rBHV1-△gE,而双基因缺失突变体pBHV1-△gN-△gE则未能观察到细胞病变。病毒噬斑大小和生长曲线试验表明,在感染细胞内和培养基中,rBHV1-△gE滴度与亲本毒株BHV1无明显差异,而rBHV1-△gN显著降低;重组病毒rBHV1-△gE和前期构建的rBHV1-△gN形成的噬斑均显著小于亲本病毒,其大小分别为亲本病毒的18%和64%。rBHV1-△gE和rBHV1-△gN的构建将有助于阐明gE与gN协同作用机制和为研制BHV1新型基因标记疫苗奠定基础。     

DEV囊膜糖蛋白gI基因缺失病毒生物学特性研究

在构建鸭瘟病毒疫苗株细菌人工染色体感染性克隆pDEV-vac的基础上,通过两步Red E/T重组,构建了gI基因缺失的pDEV-ΔgI突变体克隆,并转染鸡胚成纤维细胞获得了重组病毒rDEV-ΔgI。病毒生长曲线显示,rDEV-ΔgI的滴度从12 h到60 h稳步增加,在此期间gI基因缺失毒株病毒滴度较亲本毒株稍有降低,但病毒滴度于72 h接近并超过对照毒株。蚀斑面积测定发现rDEV-ΔgI较亲本毒rDEV-BAC增加约60%。动物实验表明,rDEV-ΔgI注射组对强毒攻击的保护率较对照组下降40%。研究表明:gI为DEV的非必需基因,且gI基因与病毒扩散、免疫保护能力等相关。     

番鸭呼肠孤病毒通用RT-PCR检测方法的建立

根据经典和新型水禽呼肠孤病毒σA基因的保守序列设计一对PCR引物,通过优化病毒RNA提取方法和PCR条件,建立了番鸭呼肠孤病毒通用RT-PCR检测方法。该方法可自1株经典型或4株新型水禽呼肠孤病毒特异性扩增出436 bp条带,其最低病毒检出量为3.6 TCID50,而对鸭甲肝病毒、鸭瘟病毒、新城疫病毒、坦布苏病毒、番鸭细小病毒、产蛋下降综合征病毒和H9N2亚型禽流感病毒扩增均为阴性。对2011~2012采集的224份(番鸭74、鹅68、鸭82)疑似临床病料进行检测,结果 56份为阳性,番鸭、鸭和鹅阳性率分别为59.5%(44/74),11.0%(9/82)和4.4%(3/68),表明水禽呼肠孤病毒主要在番鸭中流行。     

浙江省引起高致病性禽流感暴发流行的风险因子调查与分析

为明确浙江省高致病性禽流感(HPAI)发生的风险水平,我们开展了相关风险因子调查和分析工作.本研究将风险因子等级分为高、较高、中和低4个风险等级,对母源抗体、免疫抗体、家禽密度、饲养设施、禽类混养、饲养场地理位置、水禽和迁徙鸟、活禽市场等风险因子进行了定量评估.通过权重赋值评估浙江省发生的HPAI的风险水平为0.66875,判定为中等,提示浙江省发生禽流感疫情的可能性时刻存在.通过风险因子分析,发现了高致病禽流感防控工作中存在的薄弱环节,明确今后工作的重点,为浙江省HPAI管理和决策提供了依据.     

胶体金作为免疫佐剂的初探

利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，经扫描电镜观察，粒径大小为15～20nm。以牛血清白蛋白为指示抗原，以小白鼠为模式动物，设立弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂作对比，探索胶体金作为免疫佐剂的可能性。试验结果显示，胶体金能够显著提高鼠体内抗牛血清白蛋白抗体的水平，其抗体水平高于弗氏不完全佐剂试验组，而略低于弗氏完全佐剂试验组。因此，胶体金有可能开发成为新一代免疫佐剂。     

辐照灭菌的效果研究

利用60Co r射线对细菌的杀灭作用,采用不同的辐照剂量对高免卵黄液及鸭肝炎血清中大肠杆菌杀灭效果进行研究,同时测定卵黄液ND、IBD的抗体效价.结果显示:辐照剂量在3KGY时即可完全杀灭卵黄液及鸭肝炎血清中的大肠杆菌,对卵黄液抗体效价则无明显影响,但最高辐照剂量不能超过12KGY.     

大鸨禽Ⅰ型副粘病毒的病原分离与鉴定

大鸨为鹤形目鸨科。主要分布在新疆西部喀什 ,天山中部、吐鲁番和内蒙草原等地。主要采食植物性食物和无脊椎动物 ,也食小型哺乳动物、两栖动物和在陆地营巢的小鸟。其一般繁殖期为 3～ 5月 ,在东北部寒冷地区则推迟到 6月 ,性成熟雄性 5～ 6岁 ,雌性2～ 3岁。大鸨属高度神经质