猪伪狂犬病病毒天津变异株R13139对猪的致病性研究

为了解猪伪狂犬病病毒（PRV）变异株R13139株对猪的致病性情况，本试验将PRV R13139株和PRV经典强毒株SC株均以10⁶ TCID₅₀剂量经滴鼻途径接种6和9周龄健康仔猪各3头，空白对照组鼻腔接种生理盐水，通过攻毒后两个年龄段猪的临床症状表现、眼观病例变化、显微病理变化、抗体产生情况及病毒在体内部分情况评定两毒株对猪的致病力差异。结果显示，SC株对6和9周龄猪的致死率分别为66.7%（2/3）和100.0%（3/3），而R13139株对6和9周龄猪的致死率分别为33.3%（1/3）和66.7%（2/3），表明R13139株对猪的致死性弱于SC株，但R13139株引起两个年龄段猪发病时间比SC株早，同时间段的体温升高幅度更高，神经发症状更严重；眼观病理变化发现，R13139株引起的发病猪肝脏坏死现象比SC株更明显，而心脏、肺脏、脾脏、膀胱和脑的病理变化差异不明显；显微病理结果显示，R13139株对病猪的扁桃体、肺脏、肝脏和三叉神经节等组织造成的病理损伤明显强于SC株；PCR结果显示，R13139株在濒死猪扁桃体、脾脏、肺脏、三叉神经节和淋巴节（腹股沟、肠系膜和颌下）等组织脏器中分布比SC株更广泛；应用ELISA检测攻毒猪抗体发现，R13139株诱导PRV-gB抗体产生的时间比SC株早1 d。本研究结果可为揭示中国伪狂犬病重新流行的原因及进一步开展防控技术研究提供科学依据。     

Tn5转座子介导表达猪瘟E2蛋白和EGFP重组伪狂犬病毒的构建

为构建猪瘟重组伪狂犬疫苗,以Tn5转座子为介导,采用体外转座的方法将猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）E2基因和增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluoresce protein,EGFP）的表达盒随机插入伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）基因组中,随后将转座产物转染BHK-21细胞,获得表达E2蛋白和EGFP的病毒库,并对E2蛋白和EGFP在细胞上的表达效果进行PCR鉴定和间接免疫荧光分析。试验结果表明,运用体外转座的方法可以将外源基因插入PRV基因组中,并且外源基因可以在细胞中表达。本研究为重组病毒的研究提供了新思路,并为新型重组猪瘟疫苗的研制进一步奠定了基础。     

4种病毒在细胞上达最大吸附量所需时间测定

为确定鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)弱毒、鸡马立克氏病毒(MDV)弱毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪伪狂犬病毒(PRV)在细胞上达到最大吸附量所用时间,通过观察病毒在细胞上吸附不同时间后的细胞病变情况来测定病毒在该细胞上达到最大吸附量所用时间。结果表明:IBDV、MDV、PRRSV以及PRV 4种病毒在细胞上吸附一定时间后,细胞病变随着吸附时间的延长而加重,分别在60、120、60、60min时达到峰值。37℃孵育条件下,IB-DV在CEF上的吸附量在60min时达到最大值;MDV在CEF上的吸附量在120min时达到最大值;PRRSV在Marc-145上的吸附量在60min时达到最大值;PRV在PK-15上的吸附量在60min时达到最大值。     

表达猪瘟E2基因的重组伪狂犬病毒构建及其 生物学特性分析

以构建的TK、gI、gE、US9、部分gN基因缺失的绿色荧光标记猪伪狂犬病毒rPRV-BE为亲本株,通过同源重组构建了表达猪瘟病毒(CSFV C株)主要免疫原性基因E2的重组伪狂犬病毒rPRV-CSFV PE2SC。经PCR、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定证实构建正确,并能成功表达E2蛋白。同时,对重组病毒在PK15细胞中的遗传稳定性、增殖特性等进行了研究,结果显示第5、10、15、20代重组病毒经PCR均能扩增出与原代重组病毒相同大小的约为3469 bp含猪瘟病毒E2基因的重组片段;第20代重组病毒感染细胞孔中出现明显的针对E2蛋白的荧光,表明重组病毒在体外连续传20代后仍能稳定遗传。一步生长曲线测定结果表明,与野毒PRV(SX株)、亲本毒rPRV-BE相比,重组病毒rPRV-CSFV PE2SC前期增殖速度较快,病毒滴度到达峰值的时间早,峰值病毒滴度低于野毒,与亲本毒相当,最高病毒滴度依次为10~(6.7)TCID_(50)/mL、10~(8.0)TCID_(50)/mL、10~(7.0)TCID_(50)/mL。结果显示构建的重组病毒具有良好的遗传稳定性及体外复制能力,为进一步对其免疫效果的评价以及PRV基因缺失重组疫苗的研制奠定基础。     

猪伪狂犬病病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究针对猪伪狂犬病病毒的gE基因序列进行分析比较,设计了一条TaqMan-MGB探针,建立了区别野毒株及基因缺失疫苗株的荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法检测猪伪狂犬病病毒特异性强,能很好的区分猪伪狂犬病病毒与其它病毒。用该方法对83份疑似样本进行检测,与常规PCR检测法符合率达到100%,表明该方法用于检测猪伪狂犬病病毒具有良好的实用性。     

PK15、Vero、BHK、CEF细胞增殖猪伪狂犬病病毒的比较

为了研究伪狂犬病病毒,从而预防该病的发生。[方法]对PK15、Vero、BHK、CEF 4种细胞增殖猪伪狂犬病病毒后细胞病变进行比较,并对4种细胞增殖的PRV分别进行毒价测定。[结果]4种细胞增殖PRV毒价分别为:PK15细胞107.15TCID50/ml;BHK细胞107.00TCID50/ml;Vero细胞106.96TCID50/ml;CEF细胞106.70TCID50/ml。[结论]PRV毒株在不同细胞上增殖CPE表现不同,毒价也存在差异。     

2013—2018年广西地区猪伪狂犬病病毒gB、gE与TK基因遗传变异分析

为了解广西近年猪伪狂犬病（PR）流行情况及猪伪狂犬病病毒（PRV）流行株gB、gE、TK基因的遗传变异特点,于2013-2018年采集广西各地区疑似PR发病猪靶组织714份,进行PRV的PCR检测及病毒分离鉴定,并运用DNAStar、MEGA 6.0等生物学软件对分离毒株gB、gE、TK基因进行遗传变异分析。结果显示：样品检测阳性率为24.5%（175/714）,共分离获得PRV流行株38株。受检猪群普遍存在PRV感染,经典毒株及变异毒株并存,而且以变异毒株为主。广西流行株不同亚群PRV在gB、gE、TK基因上均存在相同的氨基酸变异特点,与国内变异株亲缘关系较近。推测广西流行株存在两种不同重组变异形式产生的PRV重组毒株,分别为疫苗株gB基因和变异株gE基因重组产生的重组毒株,以及经典株的TK基因被疫苗株（HB98）的TK基因替换而产生的重组毒株。近年广西受检猪场较普遍存在PRV感染,而且PRV流行株以变异毒株为主,可能存在两种不同重组变异形式产生的重组毒株,猪场需重视及实施针对性PR免疫防控计划。     

番木瓜环斑病毒株系的生物学和血清学研究

本文对华南地区番木瓜环斑病毒的Ｙｓ，Ｖｂ和Ｓｍ３个株系和夏威夷ＨＡ５－１弱株系的生物学和血清学等进行了进一步的研究。确证了ＰＲＶ在华南地区至少有３个株系。在株系间亲缘关系方面，华财３个株系间的关系较密切，而与ＨＡ５－１株系的较疏远。在西葫芦植株体内增殖和运转，Ｓｍ株系病毒增殖和运转最快，在体内的浓度最高；Ｖｂ次之；Ｙｓ再次之；而ＨＡ５－１则更次之。     

伪狂犬病病毒gG基因缺失通用转移载体的构建

对克隆有伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA SphI 15kb片段的质粒pBSA用SphI和KpnI消化，将含gG全基因及其上游PK基因，下游gD基因部分编码区的约2．6kb的片段亚克隆到消除了EcoRI位点的载体pUC19中，获得重组质粒pUSK(E)。以pEGFP-N1为模板，通过PCR扩增约0．3kb的SV40Poly(A)片段，并将其克隆到杆状病毒转座载体pFastBac1的NotI和PstI位点，利用pFastBac1的BamHI和PstI将含有9个酶切位点以及SV40Poly(A)的片段亚克隆到pUSK(E)的相应位点，在插入的同时导致gG基因5‘端编码区约9个酶切位点以及SV40Poly(A)的片段亚克隆到pUSK(E)的相应位点，在插入的同时导致gG基因5‘端编码区的400bp的缺失，构建了由gG启动子驱动gG部分编码区缺失的通用转移载体pgG-Uni。序列分析进一步证实：有7个单一酶切位点可供外源基因直接插入。上述结果为构建以伪狂犬病病毒作载体的多价基因工程疫苗以及利用标记蛋白探讨伪狂犬病病毒在体内的增殖与分布奠定了基础。