表达猪细小病毒VP2蛋白的猪伪狂犬病病毒rPRV-VP2株的生物学特性

探索重组PPV VP2基因的猪伪狂犬病病毒rPRV-VP2株作为弱毒疫苗候选株的潜在价值,对其在多种细胞上的增殖特性、病毒滴度、最适培养细胞中的遗传稳定性、一步生长曲线、转录和翻译水平等生物学特性进行研究,并初步探索对小鼠安全性。结果显示:重组病毒rPRV-VP2株在VERO、ST、PK-15和IPEC细胞上的TCID50分别为104.375/0.1mL、106.5/0.1mL、103.75/0.1mL、105.625/0.1mL。重组毒与亲本毒PRV HB-98株在ST细胞中的毒力(106.125 TCID50/0.1mL)和细胞病变相当,重组病毒保持了PRV病毒的通性。连续传毒20代后的绿色荧光观察、RTPCR、Western blot试验结果均表明重组病毒中的VP2基因得到了有效表达,且遗传稳定性良好。安全性试验结果显示:重组毒对小鼠安全。本试验为后期对PPV VP2基因重组猪伪狂犬病毒rPRV-VP2株的开发利用奠定了基础。     

利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统构建猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株

通过对4株伪狂犬病病毒(PRV)流行株进行比较,选择免疫原性最高的HNQYY2012为亲本株,利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统构建带有LoxP位点的HNQYY2012ΔgE/EGFP~+,然后利用环化重组酶(Cre)去除增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建PRV gE基因缺失株HNQYY2012ΔgE。PCR鉴定和测序结果表明,PRV gE基因缺失株构建成功;一步生长曲线表明,HNQYY2012ΔgE增殖速度慢于亲本株,但最高滴度与亲本株相近;HNQYY2012ΔgE和亲本株对小鼠的半数致死量分别为10~(3.8 )TCID_(50)和10~(2.5 )TCID_(50),表明gE基因缺失株毒力降低。制备的灭活疫苗免疫小鼠能完全抵御5LD_(50)和10LD_(50)强毒攻毒。本文利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统成功构建PRV gE基因缺失株HNQYY2012ΔgE,为猪伪狂犬病灭活疫苗的研制提供了参考。     

猪伪狂犬病病毒变异株gE/gI/TK三基因缺失株rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-的纯化及生物学特性

将猪伪狂犬病病毒(PRV)转移质粒pUC-TKLR与含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的gE/gI/TK三基因缺失PRV变异株rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-/EGFP~+基因组经脂质体转染至ST细胞中,进行无荧光重组病毒蚀斑筛选、纯化,并对该病毒在多种细胞上增殖特性、病毒滴度、一步生长曲线和遗传稳定性及其对小鼠的安全性等进行初步研究。结果显示,成功获得重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-,不含EGFP。经PCR及测序鉴定,证实获得的rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-在TK基因上缺失311 bp。rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-在ST、PK-15、VERO和MDCK细胞上的TCID_(50)分别为10~(6.375)/0.1 mL,10~(5.625)/0.1 mL,10~(5.375)/0.1 mL,10~(3.875)/0.1 mL;与亲本毒株NY在ST细胞中的毒力(10~(6.5)/0.1 mL)相近;当rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-传至20代时,病变细胞仍无绿色荧光,缺失部分TK基因(311 bp),且对小鼠是安全的。     

一株表达EGFP基因的重组伪狂犬病毒的构建及其复制稳定性分析

为探寻伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）基因缺失株rPRV-bc-8基因组UL4-UL3基因间区域是否可作为外源基因的插入位点，在实验室已构建的含有增强型绿色荧光蛋白（Enhance Green fluorescent protein，EGFP）基因的转移质粒pMD-US6+7-EGFP-US2的基础上，通过DNA体外分子克隆技术将UL4序列替换左同源臂US6+7序列，UL3序列替换右同源臂US2序列，并将PolyA引入转移质粒，得到转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3。利用脂质体转染法将转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3与亲本毒rPRV-bc-8共转染PK-15细胞，经蚀斑纯化成功得到一株能够稳定表达EGFP基因的重组伪狂犬病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3。通过倒置荧光显微镜观察以及PCR鉴定确定EGFP基因已成功插入到伪狂犬基因组的UL4-UL3之间，并通过细胞传代试验分析得到重组毒的遗传稳定性良好。通过体外增殖试验分析得到重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3在细胞内的增殖速度较快，接种后12 h内滴度始终高于亲本毒rPRV-bc-8，接种后40 h达到最高滴度10^8.3 TCID₅₀/mL，与亲本毒的最高滴度接近，但是最高滴度的出现时间晚于亲本毒，并且在达到平台期后病毒滴度下降的比亲本毒快。通过对病毒培养液中荧光蛋白浓度进行测定，结果显示在接种后56 h时荧光蛋白浓度达到最高值4793.9 ng/mL，之后进入平台期。综上结果表明构建的重组病毒具有良好的遗传稳定性及体外复制能力，并且外源基因EGFP在此位点具有良好的表达效果，为进一步相关重组病毒的构建奠定了基础。     

表达禽腺病毒4型中国流行株Fiber2蛋白重组新城疫病毒的构建与鉴定

利用NDV LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统,将禽腺病毒4型(FAdV-4)中国流行株的全长Fiber2基因插入到NDV基因组的P和M基因之间,构建并拯救出重组病毒rLaSota-Fiber2。利用RT-PCR和序列测定,以及Western blot对重组病毒进行了鉴定。结果显示,Fiber2基因插入位置和方向正确,Fiber2蛋白得到正确表达,表达形式为可溶的游离形式而非嵌入到NDV颗粒中。第10代重组病毒的鸡胚致病性试验和在鸡胚中的生长特性研究结果显示,重组病毒的半数鸡胚感染量(EID_(50))最高可达10~(8.5)/100μL,鸡胚平均致死时间(MDT)为120 h, 1日龄雏鸡脑内接种指数(ICPI)和6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)均为0,重组病毒保持了LaSota弱毒疫苗亲本毒株的低致病特性和对鸡胚良好的高滴度生长适应性。重组病毒与亲本LaSota株生长滴度在相近时间达到峰值,生长动力学特性与亲本株无明显差异。本试验构建的表达FAdV-4中国流行株Fiber2基因的重组病毒rLaSota-Fiber2有望为同时防控NDV和FAdV-4的感染提供安全、廉价和高效的辅助工具。     

带BAC质粒的重组伪狂犬病毒的构建及其体外生长特性研究

本研究通过基因克隆技术以伪狂犬病病毒(PRV)弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作为同源重组序列,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,构建了带LoxP位点的pUCTKAB-EGFP质粒,将pBeloBACII线性化后插入到pUCTKAB-EGFP中构建了转移载体pUCTK-EGFP-BACII.将PRV基因组和转移载体共转染Vero细胞,利用同源重组在Bartha K61株的TK基因中插入了BAC质粒和绿色荧光蛋白筛选标记,经过11轮噬斑纯化和鉴定证实获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC.通过噬斑试验和一步生长曲线测定等方法对重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC的生长特性进行研究,结果发现带有BAC质粒及筛选标记的重组病毒rv-PRVBAC在体外细胞培养中的增殖速度与亲本毒Bartha K61株相比没有明显差别,说明大的基因片段的插入没有影响重组病毒在体外的繁殖速度.重组病毒rv-PRVBAC在Vero细胞上盲传18代,其绿色荧光蛋白仍能够稳定表达,通过PCR鉴定可以检测到插入的外源片段和插入位点两侧的病毒基因序列,表明所获得的重组病毒rv-PRVBAC得到了稳定遗传.本研究成功获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC,为进一步开展PRV的细菌人工染色体的构建奠定了基础.     

PCV2 ORF2蛋白重组PRV病毒PGO株的生物学特性

PCV2ORF2蛋白重组PRV病毒生物学试验研究表明:重组病毒PGO株在PK15细胞、ST细胞、VERO细胞、IBRS-2细胞上病毒增殖滴度分别为104.125/0.1、106.125/0.1、104.625/0.1、106.25/0.1mL。RT-PCR、倒置荧光显微镜观察、IPMA试验结果表明插入基因在重组病毒中进行表达。该重组病毒具有PRV病毒的通性;安全性试验结果表明该重组病毒对小鼠是安全的;遗传稳定性研究表明包含有PCV2ORF2基因的重组伪狂犬病毒具有稳定的遗传性状;这些研究为研发PCV2病毒重组伪狂犬病毒疫苗奠定了基础。     

伪狂犬病病毒变异株US3基因失活株的构建与生物学特性分析

为探究US3基因失活对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)变异株毒力的影响,运用En Passant操作技术,将PRV变异株AH02LA细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)BAC~(PRV-G)中US3基因的起始密码子进行点突变,获得重组BAC株BAC~(PRV-G)-US3~(mut)。将BAC~(PRV-G)-US3~(mut)与带有同源臂和PRV AH02LA gE/gI基因的片段共转染猪睾丸(ST)细胞,拯救病毒的同时将gE/gI基因进行恢复,获得重组病毒PRV-US3~(mut)。生长动力学试验发现:PRV-US3~(mut)在感染ST细胞早期(6 h和12 h)无病变发生,在感染24 h之后,与亲本毒株PRV AH02LA生长动力学相似,表明US3基因可能介导病毒增殖的早期阶段。此外,研究发现了US3基因抑制PRV感染ST细胞早期组织相容性复合物Ⅰ的mRNA转录。BALB/c小鼠的致病力试验发现,相较于亲本毒株PRV AH02LA(LD_(50)=10~(-3.26)/0.2mL),PRV-US3~(mut)(稀释10~(-2)～10~(-5))攻毒小鼠全部存活,表明US3基因可能介导PRV对小鼠的致病性。本研究成功构建了PRV变异株US3基因失活株,为研制针对PRV变异株的弱毒疫苗奠定了基础。     

一株携带EGFP基因的重组伪狂犬病毒变异株的构建

本研究运用同源重组的方法,在伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异株PRV JS-2012基础上,构建了一株携带增强型绿色荧光蛋白基因的标记重组伪狂犬病毒,命名为r PRV JS-2012-EGFP。经PCR方法鉴定及荧光显微镜观察分析,结果表明重组病毒构建成功,并能在感染细胞中稳定表达绿色荧光蛋白。生长曲线和空斑试验结果显示,r PRV JS-2012-EGFP与亲本株PRV JS-2012在体外具有相似的生长特性。将r PRV JS-2012-EGFP毒接种14日龄PRV阴性仔猪,能使实验猪100%发病,病死率高达40%,表明r PRV JS-2012-EGFP是一株具有强致病力的标记伪狂犬病毒变异株,在伪狂犬病毒变异株致病机制研究中具有一定的使用价值。     

爱滋病毒抗原(P_(24))检测马传染性贫血病毒的研究

本研究通过基因工程技术生产了爱滋病毒的Ｐ２４抗原,并且运用于马传贫病毒的血清学检查,与传统方法所制备的马传贫抗原对照检测军马２５２４匹以及本实验室保留的各种马传贫阳性血清２２４份。结果显示马传贫血清能够免疫沉淀爱滋病毒（ＨＩＶ）的Ｐ２４,表明它们之间有着共同的抗原决定簇,且Ｐ２４检测法检测率高,检测周期仅３～４ｈ,明显优于传统法,可用于马传贫的快迅检测。     

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二重PCR检测方法的建立

通过对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因和猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因进行序列分析,本试验利用DNAStar软件分别设计2对特异性引物,扩增片段长度分别为299和437 bp,建立一种针对TGEV和PEDV感染的二重PCR鉴别诊断方法.该方法能同时检测到TGEV和PEDV,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等均无扩增,其检测TGEV、PEDV的极限为10⁴ 拷贝/μL;用该方法对临床收集的68份疑似病毒性腹泻仔猪粪便和肠道组织样本进行检测,结果表明本试验建立的二重PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查.     

Establishment of Double PCR Detection Method of Transmissible Gastroenteritis Virus (TGEV) and Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)

Two pairs of primers used to respectively amplify transmissible gastroenteritis virus (TGEV) S gene and porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) M gene were designed to develop a method of differential diagnosis of TGEV and PEDV.The established double PCR could detect S gene of TGEV with the length of 299 bp and M gene of PEDV with the length of 437 bp.Negative results using CSFV,PCV2,PRRSV and PRV as control were obtained.The detection limit of this method was 10⁴ copies/μL.68 clinical samples collected from swine farm were submitted to detect TGEV and PEDV,and the result showed that the established double PCR method with the characteristics of high sensitivity and high specificity could be widely used in clinical diagnosis and epidemiological investigation.     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒对SPF鸡的免疫保护作用

将表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的重组鸡痘病毒(rFPV-IBVS1)以5×106PFU剂量翅皮下注射接种4周龄的SPF鸡。血清抗体检测表明,该重组鸡痘病毒能刺激鸡体产生特异性抗体,外周血液中CD4 、TCRγδ T淋巴细胞比例显著高于对照组,而CD8 T淋巴细胞比例低于对照组。免疫后4周用1×103.0EID50的传染性支气管炎病毒LX4株进行攻毒,结果表明,重组鸡痘病毒免疫组与IB弱毒疫苗免疫保护率分别为12/16和13/16;攻毒后喉拭子IBV分离结果表明,IB弱毒疫苗和重组鸡痘病毒免疫组的IBV气管排毒时间比对照组缩短了2 d,病毒的分离率显著低于对照组;肾脏、气管、肺脏、腺胃、脾和肝脏的病理损伤也较对照组轻,而且病变持续时间缩短。     

鸡痘病毒PCR检测方法的建立

根据已发表的鸡痘病毒 (fowlpox virus,FPV) 4 b核心蛋白基因的核苷酸序列设计合成了 2对引物 ,通过对影响PCR扩增因素的优化 ,2对引物在同一反应条件下 ,以抽提 FPV DNA或直接用其毒液制备的模板均能分别扩增出预期的 5 4 9、136 1bp的片段。特异性检测表明 ,2对引物对 FPV10 2株、FPV2 82 E4 (北京 )、FPV2 82 E4 (吉林 )、v FV2 82重组鸡痘疫苗毒及 FPV临床分离株均能扩增出相应特异性片段 ,而用鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、羊痘病毒、鸡胚成纤维细胞 (CEF)制备的模板分别进行 PCR扩增却成阴性。敏感性检测表明 ,2对引物 (p1 ,2 、g1 ,2 )分别能检测到 10 - 2 、10 - 3fmol的 FPV DNA和 10 0 .5、10 - 0 .5TCID50 的病毒。以上结果表明 ,本试验所建立的 FPV PCR检测法具有较高的特异性和敏感性 ,模板制作简单 ,完全可用于 FPV的检测     

牛病毒性腹泻病毒在绵羊垂直感染中的抗原分布

将新疆分离的病毒性腹泻病毒（BVDV）野毒株SHN－98和标准毒株Oregon C-24分别接种无BVDV感染的羔羊和怀孕100天左右的母羊，建立BVDV在绵羊垂直感染的动物模型，应用病毒抗原定位检测的免疫组化染色技术，探求BVDV在实验性感染绵羊经胎盘感染胚胎、羔羊过程中，病毒在感染组织、靶器官、靶细胞中的分布规律。结果表明：BVDV通过母羊的胎盘感染胚胎。BVDV在感染妊娠母羊体内主要分布于心肌、肝、肺、脾、淋巴结、胃肠粘膜、脑神经、子宫粘膜、胎盘等器官组织，其中以胃肠粘膜、脾、淋巴结、脑神经、子宫粘膜、胎盘等器官组织中分布量较多；BVDV在垂直感染胚胎体内主要分布于胸腺、淋巴结、脑、肝、肾、心肌、脾、肺、胃肠粘膜、脐带等器官组织，其中以胸腺、胃肠粘膜、脑神经等器官组织中分布量较多；BVDV在垂直感染羔羊体内主要分布于心、肾、胃肠粘膜、脾、胸腺、淋巴结、大脑、小脑、海马、视丘、视神经、眼球脉络膜等器官组织，其中以胃肠粘膜、大小脑、用、视神经、淋巴结等器官组织中分布较多，在组织分布中，BVDV对上皮细胞、神经胶质细胞、淋巴细胞有较强的亲嗜性，SHN－98和OregonC-24在垂直传播中组织器官的分布无明显差异。     

无包埋体对虾病毒（NOSV）的纯化和随机文库构建

通过超薄切片和负染电镜观察，从患暴发性传染病死亡的中国对虾体组织中，发现一种无包埋体对虾病毒（ＮＯＳＶ）或称中国对虾类杆状病毒（ＰｃＢＬＶ）。对其用不连续蔗糖梯度离心纯化，观察了其核衣壳的负染结构：核衣壳平均大小为６２ｎｍ×３１４ｎｍ，由蛋白壳粒环堆砌而成，每３层环形成１个重复单位，重复单位之间有较大空隙；核衣壳一端较平，另一端近于帽状。提取纯化病毒的核酸，电泳后用低熔点琼脂糖回收，用ＥｃｏＲＩ酶切，克隆于ｐＵＣ１８质粒中，共获得１６个阳性克隆质粒，克隆片段总长度约５３．４５ｋｂ。     

伪狂犬病病毒闽A株单克隆抗体的制备与鉴定

本试验应用细胞杂交瘤技术,取健康BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞进行细胞融合,经双抗体夹心ELISA筛选,4次有限稀释法克隆,得到2株能稳定分泌抗伪狂犬病病毒(PRV)的单克隆抗体杂交瘤细胞株:2C6E6、3D5F1。2株杂交瘤细胞培养上清的效价分别为1:512、1:1 024。鉴定结果显示这2株单克隆抗体分别为IgG1亚类和IgG2a亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数目为84条。用纯化的PRV免疫经产健康的BALB/c小鼠,采用ELISA方法检测获得的腹水的效价分别为1:1 638 400和1:819 200。经检测这2株单克隆抗体与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒均不发生交叉反应,特异性良好。杂交瘤细胞连续培养30代,仍能稳定分泌抗PRV的单克隆抗体,说明这2株单克隆抗体的稳定性良好。本试验研究结果为PRV的快速诊断方法的建立奠定了理论基础。     

Preparation and Identification of Monoclonal Antibody against Min-A Strain of Pseudorabies Virus (PRV)

With purified pseudorabies virus (PRV) to immune BALB/c mice, spleen cells from imunized mice were fused with SP2/0 myeloma cells by application of lymphocyte hybridoma technique, followed by double antibody sandwich ELISA screening, four times cloning by limiting dilution method to obtain two stable secreting anti-PRV monoclonal antibody hybridoma cell lines, 2C6E6 and 3D5F1.After identification, these two monoclonal antibodies belonged to IgG1 and IgG2a subtypes, respectively, the average number of chromosomes of hybridoma cells was 84, ELISA titers of these two hybridoma cell culture supernatants and mouse ascites monoclonal antibodies were 1:512 and 1:1 638 400, 1:1 024 and 1:819 200.These two monoclonal antibodies showed no cross-reaction with classical swine fever virus, porcine reproductive and respiratory syhdrome virus and porcine parvovirus, which indicated that they had high specificity.The hydridoma cells could passage for 30 generations which could still secrete monoclonal antibody against PRV, which indicated that these two monoclonal antibodies had good stability.The results in the assay laid the foundation for establishing rapid diagnostic methods of PRV.     

乙型脑炎重组伪狂犬病病毒TK-/gG-/NS+1的安全性及免疫性

用含有日本乙型脑炎病毒 (SA14 - 14 - 2株 )非结构蛋白 NS1基因的重组伪狂犬病病毒 TK- / g G- / NS 1 免疫BAL B/ c小鼠和断奶仔猪。结果表明 ,该重组病毒对 BAL B/ c小鼠和断奶仔猪是安全的 ,免疫的 BAL B/ c小鼠能抵抗伪狂犬病病毒 (PRV )强毒 (Ea株 )的致死性攻击 ,免疫的断奶仔猪能产生乙型脑炎病毒 (JEV)特异性抗体和 JEV特异性 CTL 活性。