胎儿弯杆菌表面蛋白(SapA)基因的分段表达及其免疫原性分析

应用PCR方法扩增出胎儿弯杆菌表面蛋白基因（SapA）的2个基因片段SapA-N（1398bp）和sapA—C（1422bp）,采用DNA重组技术,将2个基因片段分别连接于表达载体pET32a（＋）,并在大肠杆菌中诱导表达（rSapA—N和rSapA—C）,用金属鳌合层析的方法纯化蛋白。以Western blot检测重组蛋白的免疫学活性,ELISA试验分析2种蛋白用于胎儿弯杆菌病血清学诊断的可能性。结果表明,以可溶形式表达的2部分蛋白分子量大小约66ku,与预期大小相符。纯化的蛋白均具有良好的免疫学活性,但蛋白rSapA-N比蛋白rSapA-C的免疫学活性高,rSapA-N具有良好的胎儿弯杆菌病血清学诊断的应用价值。     

禽四种细菌病多联菊粉及油乳剂灭活疫苗的研究

为探讨菊粉对四种常见禽细菌病灭活疫苗的佐剂效应,试验将禽多杀性巴氏杆菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡志贺氏菌和鸡绿脓杆菌分别培养至浓度为2×10~(10)cfu/mL,按等比例混合后以终浓度为0.35%甲醛37℃灭活24 h,分别制备油乳剂和菊粉多联灭活疫苗,以动物试验检测其安全性和效力。结果表明:两种灭活疫苗均具有良好的安全性,免疫后抗体水平均呈现上升趋势,且菊粉疫苗组稍高于油乳剂疫苗组。攻毒试验结果显示两种疫苗均可为试验动物提供80%以上的保护率,且菊粉疫苗组略优于油乳剂疫苗组,说明菊粉具有较好的免疫佐剂效应。     

猪传染性胸膜肺炎重组亚单位疫苗在小鼠体内的免疫机制及其保护效力

 【目的】欲构建具有较好交叉免疫保护效果的多组分重组亚单位疫苗，从而为猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研制提供参考。【方法】 利用分子克隆和重组表达技术获得了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌6种主要毒力因子rApxI、rApxII、rApxIII、rApxIV、rApfa和rOMP。并设立以灭活苗（5×108cfu）为试验I组，以重组蛋白rApxI、rApxII、rApxIII和rOMP为试验II组，以rApxI、rApxII、rApxIII、rApxIV、rApfa和rOMP为试验III组，以PBS为空白对照组。分3次免疫BALB/c小鼠，每次间隔2周，第3次免疫后的第7天以APP1型（5×109cfu）和APP2型（5×1010cfu）进行攻毒保护试验。【结果】试验II组的4种抗体水平（ApxI、ApxII、ApxIII和OMP）和脾淋巴细胞诱生IL-2水平显著高于其它3组(P<0.05)，脾淋巴细胞增殖水平也一直高于其它3组(P>0.05)。且试验II组对APP1型保护作用（9/10）明显高于试验I组（6/10）、试验III组(5/10)和对照组（0/10），而对APP2型保护作用（无肺脏损伤）也明显优于其它3组（典型肺部损伤），显示出细胞免疫和体液免疫水平与免疫攻毒保护之间存在着正相关性。【结论】试验II组通过激活体液免疫和细胞免疫，对不同血清型APP的攻击提供了很好的交叉保护作用。     

鸡传染性支气管炎病毒的遗传与变异(二)

S蛋白与IBV的血凝性有关。冠状病毒根据凝集红细胞的能力分为两大类。一类具有很强的凝血活性,如BCV、MHV、HCV和HEV等,其病毒表面除S蛋白外还存在一种具有受体酶活性的蛋白HE,能从细胞受体Neut、9AC（N-乙酰基-9-0-乙酰基神经氨酸）的-9位碳原子上去掉乙酰基后为S蛋白识别粘附。另一类冠状病毒如IBV、TGEV和FIPV等则不具HE蛋白,因而血凝活性极弱。HE蛋白的结构功能与C型流感病毒中的HEF极为相似,因而推测前一类冠状病毒可能在进化中通过异源重组获得了HE基因。采用粗制的细菌卵磷脂酶C处理可以移去IBV表面通过a-2…     

副结核分枝杆菌胞外GDSL脂肪酶MAP＿2739的酶学特性研究

本实验室前期研究发现了未见报道的副结核分枝杆菌(MAP) GDSL脂肪酶家族蛋白MAP＿2739。为进一步分析MAP＿2739的酶学特性，本实验利用生物信息学网站和软件对MAP＿2739保守结构域、二级结构、3D同源建模等分析，进一步确认其属于GDSL脂肪酶家族蛋白。以MAP参考株基因组DNA为模板，PCR扩增获得map＿2739目的基因约891 bp，克隆于表达载体p ET-22b中，构建重组质粒p ET-22b-map＿2739，转化大肠杆菌感受态细胞，经IPTG诱导表达、蛋白复性、Ni-TNA柱亲和层析纯化后，利用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达及纯化效果，并通过western blot鉴定。结果显示，获得了以包涵体形式表达的经复性的纯化重组MAP＿2739蛋白(rMAP＿2739)。利用该蛋白制备兔多克隆抗体，通过ELISA方法检测，多抗血清效价为1:51 200。经差速离心法分离MAP参考株组分，利用该多克隆抗体为一抗，通过western blot检测，结果显示在细胞壁、细胞膜和细胞浆均出现35 ku的特异性条带，表明MAP＿2739为胞外蛋白。以对硝基苯基酯(p-NPs)...     

薰衣草纯露对新疆褐牛生长性能和血清生化指标的影响

为了解薰衣草纯露对新疆褐牛生长性能和血清生化指标的影响，试验将48头新疆褐牛随机均分为4组，分别为1组(对照组)和2组、3组、4组(饲喂添加0.5%、1.0%、1.5%薰衣草纯露的全混合日粮),预试期7 d,正试期40 d,于正试期第1,40天分别称重，记录每头牛体重并计算平均日增重(ADG);试验第4～10天每天记录投料量和剩余量，计算每头牛的平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G);第20,40天尾静脉采血，采用试剂盒检测血清中的部分生化指标和抗氧化指标。结果表明：3组ADG显著高于1组和4组(P<0.05),各组间ADFI均差异不显著(P>0.05);3组F/G显著低于1组和4组(P<0.05)。第20天时，1组总胆固醇(TC)浓度显著高于2组和3组(P<0.05),极显著高于4组(P<0.01);4组尿素氮(BUN)浓度显著低于另外3组(P<0.05)。第40天时，3组白蛋白(ALB)质量浓度显著高于1组(P<0.05),总蛋白(TP)质量浓度显著高于1组和2组(P<0.05);1组的TC浓度显著高于2组(P<0.05),...     

结核分枝杆菌复合群、副结核分枝杆菌和禽分枝杆菌禽亚种多重TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

结核分枝杆菌复合群(MTBC)、包括结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌(MB)、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等；非结核分枝杆菌(NTM)中禽分枝杆菌(MA)是自然界常见的动物致病菌，包含4个亚种，分别为禽分枝杆菌禽亚种(MAA)、禽分枝杆菌人/猪亚种(MAH)、禽分枝杆菌副结核亚种/副结核分枝杆菌(MAP)和禽分枝杆菌森林土壤亚种(MAS)。为建立MTBC、MAP和MAA的多重荧光定量PCR检测方法，本研究基于MTBC、MAP和MAA的特异性基因devR、F57和IS901分别设计引物及探针，通过优化各反应条件，建立了一种可同时检测3种分枝杆菌的多重Taq Man荧光定量PCR方法。特异性试验结果显示，该方法对MTB、MB、MAP、MAA和MAS检测为阳性，对其他畜禽病原菌，包括MAH、13种NTM和7种非分枝杆菌检测结果均为阴性，特异性较强。敏感性试验结果显示，该方法对MB、MAP和MAA重组质粒标准品的检测限均为1.0拷贝/μL，敏感性较高；重复性试验结果显示，批内与批间重复性试验变异系数均小于2.5%，重复性较好。利用该方法检测体外模拟污染(MB、MAP和MAA菌液浓度分别为1.0...     

铜绿假单胞菌flg E基因壳聚糖纳米DNA疫苗的免疫效果评估

为评价铜绿假单胞菌flgE基因壳聚糖纳米DNA疫苗的免疫效果，本研究经PCR扩增flgE基因，将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建flgE基因的重组质粒pflgE，进一步以壳聚糖为佐剂制备了纳米DNA疫苗CpflgE，通过测定OD260nm值检测纳米DNA疫苗的包封率、加入DNA酶后经琼脂糖凝胶电泳检测其抗DNA酶降解的能力、37℃恒温静置1 d,3 d和5 d后经琼脂糖凝胶电泳检测稳定性。结果显示CpflgE的包封率为94.69%，可有效抵抗DNaseⅠ的降解，具有较强的稳定性。以pflgE和CpflgE免疫BALB/c小鼠，共免疫3次，同时设置灭活疫苗免疫组、铜绿假单胞菌鞭毛蛋白亚单位疫苗免疫组以及PBS对照组。免疫后不同时间经间接ELISA测定各组小鼠血清抗体水平，MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平，采用检测试剂盒测定各组小鼠血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的水平。结果显示，Cpflg E诱导小鼠的血清抗体水平、脾淋巴细胞增殖水平及血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的浓度总体上虽均低于灭活疫苗，但与鞭毛蛋白亚单位疫苗相当，且显著高于pflgE (P<0....     

PCV2-HPS二联亚单位疫苗对小鼠免疫保护效果的评价

为评价猪圆环病毒2型-副猪嗜血杆菌二联亚单位疫苗(以下简称二联苗)对小鼠的免疫保护效果，本研究将猪圆环病毒2型(PCV2) cap基因克隆至p MAL-c5X载体中，并通过原核系统表达了重组Cap蛋白(rCap)。通过western blot检测显示原核表达的r Cap与PCV2单克隆抗体发生特异性结合，表明r Cap具有良好的反应原性。利用本研究室已经纯化并保存的副猪嗜血杆菌(HPS)重组蛋白r Cdt B、r Afua和r OPPA，与r Cap蛋白以及佐剂ISA201VG混合乳化后制成PCV2-HPS二联亚单位疫苗，疫苗中各蛋白(rCdtB、r Afua、r OPPA、r Cap)浓度均为50μg/300μL。将60只6周龄BALB/c小鼠随机均分成免疫组和对照组，采用背部多点注射方式免疫，首免后间隔14 d二免。一免后以及二免后的14 d分别通过颌下采血方法采血，通过间接ELISA方法检测各组小鼠血清中的特异性抗体，结果显示，二免后14 d，免疫组小鼠血清中CdtB、OPPA、Afua抗体水平分别与PBS+ISA201VG对照组和免疫之前比较均极显著提高(P<0.0001...     

结核分枝杆菌PE26蛋白调节巨噬细胞免疫反应进而促进分枝杆菌胞内定殖

结核分枝杆菌(MTB) PE/PPE家族蛋白介导MTB与宿主间的相互作用，调节宿主炎症反应，有助于其的存活和疾病发展。为研究PE/PPE家族中PE26蛋白的作用，本实验利用PCR扩增pe26基因片段，构建重组载体p AIN-PE26，转化耻垢分枝杆菌(Ms)构建重组菌p AIN-PE26/Ms，经western blot鉴定结果显示，p AIN-PE26/Ms正确表达重组PE26蛋白(rPE26)。利用差速离心分离p AIN-PE26/Ms亚细胞组分，经western blot鉴定结果显示，r PE26定位于p AIN-PE26/Ms细胞壁。通过p AIN-PE26/Ms的菌落形态观察和生长曲线测定，结果显示，p AIN-PE26/Ms菌体表面较p AIN/Ms对照组更粗糙，脊不规则且相对较高，褶皱不明显；p AIN-PE26/Ms生长速度较对照组极显著增加(P<0.001)。利用H37Ra感染巨噬细胞，通过q RT-PCR检测pe26转录水平，结果显示，H37Ra感染巨噬细胞后pe26转录水平极显著增加(P<0.001)。利用p AIN-PE26/Ms感染巨噬细胞，分别通...