非洲猪瘟病毒B318L蛋白的多克隆抗体的制备及应用

非洲猪瘟病毒(ASFV) B318L是ASFV编码的晚期蛋白，具有香叶基香叶基合成酶活性。为了制备B318L的多克隆抗体并将其初步应用，本研究利用PCR方法从重组质粒p CAGGS-HA-B318L中扩增ASFV B318L基因构建重组表达质粒p GEX-6p-1-B318L，经PCR和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21 (DE3)经IPTG诱导并克隆至p GEX-6p-1载体中，采用GST亲和层析柱纯化重组蛋白，利用SDS-PAGE检测该蛋白的表达，采用western blot鉴定重组蛋白的纯化效果和反应原性，采用超微量紫外分光光度计测定蛋白浓度。结果显示，在约60 ku处出现特异性条带，且重组B318L蛋白(rB318L)主要以可溶性形式表达；纯化后在约60 ku处出现了单一特异性条带，经超微量紫外分光光度计测定蛋白浓度为10 mg/m L。将纯化的r B318L 4次免疫小鼠并于3免后一周采血，采用western blot鉴定该多克隆抗体(pAb)，经Protein G亲和层析介质纯化后采用SDS-PAGE进一步鉴定纯化效果，采用间接ELISA检测p Ab的效价。结果显示，制备的...     

副结核分枝杆菌MAP1068胞外蛋白酶的特性研究

为研究副结核分枝杆菌(MAP)1068蛋白的特性,本研究以MAP参考株K10基因组为模板,PCR扩增其map1068基因,构建p ET28a-map1068重组载体,将其转化BL21后诱导表达并纯化MAP1068蛋白。利用纯化的重组蛋白免疫(100μg/只/0.1 m L)小鼠制备多克隆抗体,应用该抗体对MAP1068蛋白进行亚细胞定位。以酪蛋白为底物测定MAP1068蛋白的酶活性。结果显示,MAP1068蛋白以包涵体形式表达;经变性、复性、亲和层析纯化后获得目的蛋白;将该蛋白免疫小鼠后其血清抗体效价可达1∶204 800;该蛋白主要定位于MAP细胞壁,可降解酪蛋白,为胞外蛋白酶。本实验为进一步研究MAP的致病机制奠定了基础。     

犬瘟热病毒N基因原核表达及多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。     

猪流行性腹泻病毒中和表位区S1D的原核表达及免疫原性分析

为了研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白中和表位区S1D的免疫原性,根据PEDV河南株(Gen Bank:YK649107)S1基因序列,设计1对特异性引物,PCR扩增S1D片段,克隆到p ET-28a(+)中,构建原核表达载体,经优化的IPTG浓度诱导后进行SDS-PAGE分析,利用His标签的特性重组蛋白进行纯化及Western blot分析。结果显示:中和表位S1D片段在p ET-28a(+)中高效表达;Western blot证明重组蛋白可以与PEDV阳性血清产生特异性反应;用纯化的蛋白免疫新西兰白兔,抗体水平升高,表明重组蛋白具有良好的免疫原性。     

火鸡组织滴虫ME 1基因的原核表达及其定位分析

为研究火鸡组织滴虫(Histomonas meleagridis)胞质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)依赖性苹果酸酶(ME 1)的抗原性及其在火鸡组织滴虫中的定位，本研究根据本实验室前期对火鸡组织滴虫ME 1基因的测序结果设计引物，以虫体cDNA为模板，经RT-PCR扩增火鸡组织滴虫ME 1 (HmME 1)基因，结果显示Hm ME 1基因全长1 182 bp，将其克隆至p ET28a(+)构建重组表达载体后转化BL21 (DE3)，经IPTG诱导表达后，利用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白r Hm ME 1，经SDS-PAGE和western blot鉴定，结果显示，r Hm ME 1以可溶形式存在，相对分子量约为46 ku，且纯化的r Hm ME 1条带单一，浓度为0.4 mg/mL。将该纯化的r Hm ME 1免疫小鼠，制备该重组蛋白的鼠抗血清(多克隆抗体)，采用间接ELISA方法检测多克隆抗体的效价，结果显示制备的多克隆抗体效价为1∶409 600。采用western blot分别检测r Hm ME 1与制备的鼠源r Hm ME 1阳性血清和鸡源火鸡组织滴虫阳性血清的反应...     

猪肠道组织RIG-I的表达及其在猪传染性胃肠炎病毒致病机制中作用的初步研究

为探究天然免疫分子维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-I)在猪肠道组织中的表达情况，评价其在猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)致病机制中的作用。本研究经原核表达重组RIG-I蛋白(rRIG-1)并采用SDS-PAGE切胶纯化该蛋白，将其免疫大白兔制备兔RIG-I多克隆抗体，采用间接ELISA检测抗体效价。结果显示获得了效价可达1∶64 000的兔RIG-I多克隆抗体。利用该抗体经western blot检测SPF猪各肠道组织中RIG-I的表达。结果显示，制备的多克隆抗体可与猪各肠道中的RIG-I反应，且RIG-I在SPF猪空肠中的表达量最高。利用该抗体经western blot检测TGEV感染的ST细胞及猪空肠中RIG-I的表达水平。结果显示，TGEV感染后ST细胞中RIG-I的表达水平极显著高于空白对照细胞(P<0.01)；与正常SPF猪空肠相比，TGEV感染的SPF猪空肠组织中RIG-I蛋白的表达水平明显提高。表明TGEV感染后能够刺激细胞内源性及感染猪肠道组织中RIG-I蛋白的表达水平。将本研究构建的重组质粒p CAGGS-RIG-I-flag和RIG-I干扰RNA (siRIG-I)分...     

鸡源性HMGB1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

从鸡胚原代细胞CEF中扩增出鸡HMGB1基因,构建重组原核表达质粒p ET-28a-ch HMGB1,并将p ET-28a-ch HMGB1转入大肠杆菌BL21(DE3)中,于37℃进行诱导表达,经SDS-PAGE分析表明该重组蛋白可以在大肠杆菌中高效表达且以可溶性蛋白的形式存在。蛋白通过Ni-NAT纯化树脂亲和纯化,并作为免疫原制备鼠抗ch HMGB1多克隆抗体血清。该多克隆抗体同时具有ELISA、Western blot和IFA效价,且特异性识别禽源细胞内HMGB1蛋白。     

禽网状内皮组织增生症病毒env基因的原核表达及其多克隆抗体制备

为原核表达禽网状内皮组织增生症病毒(REV)env蛋白及制备抗env蛋白的高效价多克隆抗体,本研究以pMD18T-env(HLJR0901株)为模板,扩增得到REV的env全长基因,将其克隆于pET-32a(+)中。将阳性重组质粒pET-env转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达。利用亲和层析纯化重组蛋白,复性后免疫BALB/c小鼠,制备抗env多克隆血清。SDS-PAGE及western blot结果表明,env基因以融合蛋白形式获得正确表达,相对分子质量约为84ku,表达产物具有良好免疫原性;IFA结果显示,制备的抗env多克隆血清能与REV野毒株特异性反应;ELISA效价达到1∶105以上。该研究为REV的检测及env蛋白的深入研究奠定了基础。     

犬p27蛋白在犬乳腺肿瘤中的表达分析

为分析犬p27蛋白在犬乳腺肿瘤组织中的表达情况,本研究构建了原核表达重组质粒pET-p27,进行重组蛋白的表达,并将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔,制备了抗犬p27蛋白多克隆抗体。将制备的犬p27抗体对临床84例犬乳腺肿瘤组织中的犬p27蛋白表达情况进行了检测。结果显示,制备的抗体效价达1∶12 800以上;western blot检测显示,该多克隆抗体能够与重组蛋白发生特异性反应;免疫组织化学试验表明,犬p27蛋白在犬恶性乳腺肿瘤组织中表达率低于犬良性乳腺肿瘤组织,提示犬p27的表达水平可能与犬乳腺肿瘤的恶性程度相关,本实验为进一步研究犬p27蛋白的生物学功能奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p17蛋白的哺乳动物细胞表达及鉴定

研究旨在利用哺乳动物细胞悬浮培养系统表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p17蛋白,纯化并免疫小鼠,制备针对ASFV p17蛋白的特异性多克隆抗体。根据GenBank中公布的ASFV SY18毒株p17蛋白编码基因序列,设计特异性引物扩增p17基因片段,构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-p17-strep。将其瞬时转染293i细胞,并利用下游strep标签进行蛋白纯化。纯化后的重组p17蛋白配合MnJ(β)胶体锰佐剂免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体血清。利用Western blot、间接免疫荧光试验鉴定该多克隆抗体的反应原性和特异性。结果显示：本试验成功构建pCDNA3.1-p17-strep真核表达质粒,转染293i细胞后纯化获得重组p17蛋白。免疫小鼠后制备的多克隆抗体与真核表达的p17蛋白及表达ASFV p17蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒均有良好的特异性免疫反应。本试验为深入探讨ASFV p17蛋白的生物学功能奠定了基础。     

Asia 1型口蹄疫病毒VP1基因的表达鉴定及其多抗制备

本研究旨在表达口蹄疫病毒(FMDV)的VP1全基因并制备特异性的多克隆抗体。利用PCR方法扩增Asia 1 IND 49197株VP1全基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为31.6ku,以包涵体的形式存在。通过Ni-NTA Purification System纯化后进行western blot和间接ELISA分析,结果显示重组蛋白能够被FMD阳性血清识别,具有良好的反应性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶20480,病毒中和试验测定抗体效价为1∶64。本研究所表达的VP1蛋白可用于开发检测Asia1口蹄疫抗体的诊断试剂,所制备的多克隆抗体为进一步研究VP1的结构、功能以及抗原表位的鉴定提供了条件。     

马链球菌马亚种FNEB蛋白的截短表达及其免疫保护性研究

为研究马链球菌马亚种FNEB蛋白的免疫保护性,本研究采用PCR方法从马链球菌马亚种新疆分离株中扩增FNEB基因部分片段,克隆于原核表达载体p ET-30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白大小约60 ku,具有良好的抗原性。将纯化的重组蛋白免疫小鼠后,以马链球菌马亚种新疆分离株进行攻毒,结果显示该重组蛋白对免疫组小鼠具有保护力,保护率为65%。本研究克隆了马链球菌马亚种的FNEB截短基因并表达了相应重组蛋白,免疫小鼠后能够提供较好的保护,为重组FNEB蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。     

副猪嗜血杆菌4种疑似毒力因子多克隆抗体的制备与鉴定

在利用蛋白质非标记定量技术(Lable-free)分析副猪嗜血杆菌强毒株与无毒株差异蛋白的基础上,筛选出4种疑似毒力因子,通过基因扩增后克隆入原核表达载体p ET-32a,构建重组质粒,转入Rosetta菌株后成功表达了目标蛋白。重组蛋白经亲和层析纯化后免疫小鼠,制备多克隆抗体,并将其与菌体蛋白进行Western blot验证。结果表明,表达的4种蛋白免疫原性良好,制备的多克隆抗体免疫反应条带单一。该研究为从蛋白水平上探讨副猪嗜血杆菌毒力因子的功能奠定了基础。     

鸭肠炎病毒VP22蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备抗鸭肠炎病毒(DEV)VP22蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究以DEV Clone-03基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增UL49基因并克隆至pMD-18载体.重组质粒经测序鉴定后,将UL49基因亚克隆于原核表达载体pET-30a,构建重组表达质粒pET-30a-UL49.重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,在大肠杆菌中获得表达,并对表达的重组蛋白VP22进行western blot鉴定.结果显示,表达的重组蛋白分子量约为36 ku,与预期的大小一致.重组蛋白能够被鼠抗DEV阳性血清所识别,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性.将重组蛋白纯化、复性后免疫BALB/c小鼠,制备MAb,经间接ELISA、western blot和间接免疫荧光试验进行筛选及鉴定.获得4株能够稳定分泌抗DEV VP22蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2810、2G1、3F10和3G2.其MAb亚类分别属于IgG2b、IgG2b、IgA和IgM.4株MAbs都能够与DEV Clone-03发生特异性反应,表明能够识别天然构象的VP22蛋白.这4株MAb可用于DEV VP22蛋白功能研究及抗原表位的研究.     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒gag蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为获得纯化的山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV)gag蛋白和抗gag蛋白的多克隆抗体,根据GenBank已登录的ENTVgag基因序列,设计合成1对特异性引物,应用PCP扩增gag基因并连接于原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-gag,经鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。重组菌经IPTG诱导后成功表达相对分子质量约为69 000的重组蛋白,重组蛋白经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后免疫小鼠制备多克隆抗体。Western blot试验表明,重组蛋白能与制得的多克隆抗体反应,而与正常小鼠血清和山羊地方性鼻内肿瘤患羊血清不反应。本试验成功获得了纯化的ENTV gag蛋白和小鼠抗gag蛋白的多克隆抗体,为进一步研究gag蛋白在ENTV致病过程中的作用提供了材料。     

扩展莫尼茨绦虫vasa基因的原核表达及多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化扩展莫尼茨绦虫VASA蛋白,并制备兔抗VASA多克隆抗体。根据扩展莫尼茨绦虫全基因核苷酸序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增vasa基因片段;将扩增产物与原核表达载体pET-22b(+)连接,获得重组质粒pET-22b-VASA;经Amp抗性筛选阳性菌,双酶切、PCR测序鉴定后,将其转化大肠杆菌(DE3)感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达;重组融合蛋白经镍柱纯化后,进行Western blot鉴定;将融合蛋白免疫兔,制备多克隆抗体。结果显示,重组质粒pET-22b-VASA构建正确,通过IPTG诱导获得大小约32 200的VASA重组融合蛋白;Western blot分析表明其与鼠抗His单克隆抗体呈阳性反应。纯化的VASA蛋白免疫兔获得了多克隆抗体,ELISA检测其效价为1∶128 000。本试验成功制备了具有免疫原性的VASA蛋白及其兔源多克隆抗体,为VASA蛋白生物学功能及该蛋白在绦虫体内的分布等研究奠定基础。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多克隆抗体制备及鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白的兔源多克隆抗体,本研究利用表达BVDV E2蛋白的重组质粒pET30a-E2转化E.coli BL21(DE3),经诱导表达获得重组E2蛋白。Western blot检测显示纯化蛋白能够与BVDV参考阳性血清反应。以纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,病毒中和试验测定其中和效价为1:2048,间接免疫荧光和western blot试验表明其具有良好的反应性和特异性。本研究制备的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体可应用于BVDV的检测,同时为进一步建立检测BVDV E2蛋白的ELISA方法奠定基础。     

非洲猪瘟病毒A137R蛋白多克隆抗体的制备与应用

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种高致病性病毒性传染病。为制备兔抗ASFV A137R蛋白多克隆抗体,本研究以ASFV Pig/HLJ/2018分离株基因组DNA为模板扩增ASFV A137R基因,将其克隆至原核表达载体pET-21a(+)中,构建重组表达质粒pET-21a-A137R,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示,表达的A137R重组蛋白分子质量约15.0 ku,其主要以可溶形式表达。利用HisTrap亲和层析和凝胶过滤层析纯化获得高纯度的A137R重组蛋白,利用该纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗ASFV A137R蛋白多克隆抗体,经Protein G亲和层析介质纯化后经western blot、间接免疫荧光和免疫共沉淀试验检测结果显示,制备的兔抗ASFV A137R蛋白的多克隆抗体能特异性地识别HEK293T细胞中瞬时表达的ASFV Flag-A137R蛋白和ASFV感染猪肺泡巨噬细胞中表达的ASFV A137R蛋白。本研究为进一步探究ASFV A137R蛋白的功能、其在ASFV感染及致病性中的作用和诊断技术研究奠定了基础。     

基于截短绵羊鹦鹉热衣原体r MOMP183-390蛋白的间接ELISA检测方法建立与应用

为建立绵羊鹦鹉热衣原体(Cp)间接ELISA抗体检测方法，本实验将编码Cp主要外膜蛋白MOMP的omp A基因序列按大肠杆菌密码子偏好性优化后，合成质粒p ET-28b (+)-omp A，另外设计特异性引物，分别将omp A截短克隆至p ET-28b(+)载体中构建重组表达质粒p ET-28b(+)-omp A_1-182和p ET-28b(+)-omp A_183-390，测序鉴定正确后分别转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，经IPTG诱导并纯化后，经western blot鉴定3个重组蛋白，结果显示，重组MOMP_183-390蛋白(r MOMP_183-390)表达效果最好。以r MOMP_183-390作为包被抗原，采用方阵滴定法优化各反应条件，初步建立了检测Cp抗体的间接ELISA方法。采用建立的该方法检测羊痘病毒、布鲁氏菌、羊口疮病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒等羊临床常见病的阳性羊血清，结果显示，除Cp外，该方法与其他阳性羊血清均无交叉反应，特异性强；将C...     

禽流感病毒NS2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备禽流感病毒(AIV)NS2蛋白的多克隆抗体,本研究将人工合成的NS2基因克隆至表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-NS2重组蛋白。SDS-PAGE和western blot试验表明,该重组蛋白获得大量表达,可溶性高,并且具有较好的反应原性。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1∶20 000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与NS2蛋白特异性结合。