黄早四泛素连接酶Rbx1的分子克隆及原核表达

通过RT-PCR方法和基因克隆技术对黄早四Rbx1基因进行分子克隆和序列分析,构建黄早四Rbx1的原核表达系统,成功表达出带有His标签的黄早四Rbx1融合蛋白,并进一步利用His抗体,用蛋白免疫印迹的方法对重组蛋白进行鉴定。结果表明,重组蛋白能够与His抗体发生免疫反应,验证了黄早四Rbx1在原核表达系统中成功表达。     

检测肥育猪CAST蛋白的免疫印迹方法研究

为了研究3个不同蛋白质水平(10%、18%、26%)饲粮对肥育猪的钙蛋白抑制蛋白酶(CAST)的影响,对CAST蛋白提取、电泳、转膜等条件进行优化。试验表明:CAST被激活的条件是将蛋白提取液于上样缓冲液95℃煮15min后,立即在冰块上冷却,防止蛋白降解;采用分离胶浓度为10%进行电泳,可以明显检测到68kD、107 kD的CAST;采用预染Marker和DAB染色液可针对性地检测到目的蛋白的位置;利用上述程序检测到了猪CAST两种类型的表达,取得了较满意的结果。     

L酪氨酸印迹聚合物的本体聚合法制备及性能

运用本体聚合法制备L-酪氨酸分子印迹聚合物,并考察了聚合物的性能.在单因素试验考察功能单体的种类及用量、交联剂的种类及用量、溶剂种类和反应温度对制备分子印迹聚合物影响的基础上,进一步以3水平4因素的正交试验优化反应条件.利用傅立叶红外光谱分析聚合物的结构,通过荧光分光光度法分析聚合物对L-酪氨酸的选择性吸附、萃取效率和...     

实时荧光PCR检测转基因大豆外源基因的拷贝数

快捷、准确地检测转基因植物中外源基因的拷贝数,是转基因生物育种的重要研究内容,具有较大的应用前景。本研究以7个抗虫BT(Bacillus thuringiensis)和抗草甘膦EPSPS-G10转基因大豆事件为材料,以SYBR Green I为荧光染料,利用实时荧光定量PCR方法,根据PCR反应获得的Ct值与起始模板数的对数值存在线性反比关系这一原理,建立了相关性系数在0.99以上的模板定量标线。通过目的基因与内参基因——大豆肌动蛋白编码基因ACTIN的起始模板量比较,估算出各株系的目的基因拷贝数。数据显示,株系1、2、3和4的2个基因均为单拷贝,株系6的2个基因均有2个拷贝,株系5和7的2个基因的拷贝数为3。利用Southern印迹方法对材料1~4的拷贝数进行验证,结果表明,两者的检测结果基本一致,证明实时荧光PCR检测法是大豆外源基因拷贝数检测中快速有效的方法。实时荧光PCR高效快速检测基因拷贝数,对于大规模转基因株系的外源基因拷贝数检测应用具有重大意义。     

戊唑醇分子印迹传感器制备及其农药残留检测的电学传感机理分析

以甲基丙烯酸为功能单体,戊唑醇(tebuconazole,TEB)为模板分子,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,应用电化学聚合法制备了分子印迹电化学传感器(TEB-MIP/F-CNTs/GCE)。利用循环伏安法(cyclic voltammetry,CV)和交流阻抗法(electrochemical impedance spectroscopy,EIS)对新型传感器进行了表征,并用差分脉冲伏安法(differential pulse voltammetry,DPV)考察了新型传感器对戊唑醇的检测性能。结果表明:戊唑醇分子印迹电化学传感器具有一定特异性;传感器表观表面积比裸电极显著提高;新型传感器具有良好的印迹效果,相较于其他结构类似的三唑类化合物(如苯醚甲环唑),TEB-MIP/F-CNTs/GCE对戊唑醇表现出高效的识别能力,具有专一性和强选择性,且在C_(TEB)≤2.0×10~(-6)mol/L范围内传感器峰电流与C_(TEB)存在定量关系;数据模拟分析得到传感器的电学阻抗谱等效电路模型为R_1(CPE_1(R_2(CPE_2(R_3)))),计算各电极/传感器的等效电路中各元件参数,证明该模型能有效地模拟传感器检测戊唑醇的传感机理。该研究结果可为三唑类农药残留仿生免疫检测方法的建立提供技术支撑。     

分子印迹-基质固相分散萃取-高效液相色谱法测定土壤中4种硫代磷酸酯类农药残留量

建立了一种高效、选择性强的分子印迹-基质固相分散萃取结合高效液相色谱测定土壤中4种硫代磷酸酯类农药(毒死蜱、甲基立枯磷、甲基毒死蜱、甲基对硫磷)残留量的方法;并以甲基立枯磷为模板分子,以甲基丙烯酸(MAA)为功能单体,且n(模板分子)∶n(功能单体)=1∶4,以乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂,以偶氮二异丁腈为引发剂,采用沉淀印迹聚合方法,合成了甲基立枯磷高分子印迹聚合微球(MIPs);以MIPs作为土壤样品提取液的基质固相分散吸附剂,采用HPLC检测处理后的样品,流动相为V(乙睛)∶V(0.1%乙酸水溶液)=3∶1,流速0.8 m L/min,进样量20μL,检测波长210 nm,采用Agilent Eclipse XDB-C8色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),柱温25℃。结果显示:MIPs对甲基立枯磷有特异性吸附,对其结构相似物毒死蜱、甲基对硫磷和甲基毒死蜱也具有一定的吸附性能;在0.01~5.0 mg/kg范围内,各药剂的质量浓度与相应的峰面积间呈良好的线性关系,相关系数r为0.997 5~0.999 8;4种硫代磷酸酯类有机磷杀虫剂的检出限(LOD)为0.452~1.226μg/kg;添加回收率为76%~96%,相对标准偏差(RSD)为2.8%~7.3%。该方法可用于土壤中硫代磷酸酯类有机磷杀虫剂残留量的测定。     

北柴胡转录因子BcAP2-13的原核表达 和多克隆抗体制备

利用带有促溶标签SUMO和纯化标签6×His的原核表达载体,构建了调控北柴胡皂苷生物合成的转录因子基因BcAP2-13的原核表达载体p13-SUMO-His6。载体热激转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)后,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导培养,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明,28℃和37℃不同温度诱导条件下均得到了融合蛋白13-SUMO-His 6。以Ni-NTA柱纯化的融合蛋白为抗原,免疫成年兔4次以制备多克隆抗体。间接酶联免疫法检测结果表明,所得抗体效价较高。提取北柴胡毛状根及BcAP2-13超表达毛状根的总蛋白,免疫印迹检测结果表明,在2种毛状根蛋白样品中均能检测到与预计13-SUMO-His6蛋白分子量大小一致的条带,BcAP2-13过表达毛状根总蛋白样品的条带强于普通毛状根总蛋白样品的条带,与预期一致。成功制备了北柴胡BcAP2-13的多克隆抗体,为进一步研究北柴胡转录因子BcAP2-13的确切作用位点和调控机制奠定了基础。     

水稻转录因子OsWRKY68蛋白质的表达特征及其功能特性

【目的】 水稻中有近百个WRKY转录因子家族成员,其中很多与生长发育、生物与非生物逆境胁迫应答有关。河北农业大学生命科学学院分子生物学与生物信息学实验室（molecular biology & bioinformatics lab,MBB）前期发现OsWRKY68在水稻接种白叶枯病菌后诱导表达,本研究试图进一步探究OsWRKY68的功能。【方法】 采集水稻TP309不同生长发育时期的组织样品,包括萌发期、幼苗期、分蘖期、孕穗期和开花期的根、茎、叶、叶鞘、叶枕、穗子、花药、颖壳和种子,以及非生物胁迫（4℃、44℃、48℃、淹、NaCl、PEG、恒光和恒暗）和激素处理（脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸和乙烯利）的叶片,提取总蛋白质,用水稻OsWRKY68蛋白质特异抗体,通过免疫印迹（western blot,WB）技术系统调查OsWRKY68蛋白质在水稻正常发育过程中不同时期、不同组织、非生物胁迫及激素处理条件下的表达特征。构建RNAi载体,通过农杆菌介导的方法转化水稻TP309,对转基因植株进行PCR和WB鉴定,观察OsWRKY68 RNAi转基因植株的表型并测量其株高、分蘖数、穗长、小穗数和结实率等性状。【结果】 调查OsWRKY68蛋白质的表达丰度,发现OsWRKY68蛋白质在水稻正常生长发育过程中基本呈组成型表达,且在大部分组织中表达丰度差异倍数不大,但在开花期的花药中OsWRKY68表达量高于成熟穗、穗轴和颖壳;在分蘖期和孕穗期的叶鞘中不表达,仅在开花期的叶鞘中表达;在孕穗期的幼穗中,随着幼穗长度的增加其表达丰度逐渐降低。调查水稻非生物胁迫和激素处理后OsWRKY68蛋白质的表达特征,发现盐胁迫后OsWRKY68蛋白质的表达丰度随时间延长持续下降,恒光处理后OsWRKY68蛋白质表达量持续上升,3 d时明显出现一条分子质量较大的条带（记作OsWRKY68 ⁺）,且表达量逐渐增加,茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）和乙烯利（ethephon,ET）处理后同样也呈现OsWRKY68 ⁺蛋白质丰度的增加。对转基因植株进行鉴定和自交繁殖,对T₃代的4个OsWRKY68 RNAi转基因株系（Y316、Y317、Y326和Y337）进行PCR和WB鉴定,均表现阳性。在转基因植株中,OsWRKY68蛋白质的表达量均低于野生型TP309。对转基因植株进行表型观察和性状测量,发现与野生型相比转基因植株的株高降低、分蘖数和结实率下降等。 【结论】 OsWRKY68蛋白质在水稻正常生长发育中发挥作用,敲低OsWRKY68蛋白质的表达能影响水稻的正常生长。OsWRKY68蛋白质可能参与盐、光照、茉莉酸甲酯和乙烯介导的信号转导过程。     

转基因水稻中CP4-EPSPS蛋白质的检测及其表达特征研究

为了建立转基因水稻中CP4-EPSPS蛋白质的免疫学检测方法,并了解其在水稻生长过程中的表达特征,本研究在大肠杆菌中表达了CP4-EPSPS蛋白质,纯化后以其为免疫原免疫小鼠,经筛选获得了可识别CP4-EPSPS的单克隆抗体。建立了用免疫印记技术检测转基因水稻中CP4-EPSPS蛋白质的方法,该方法可以从单粒稻米的0.63%材料中检测到CP4-EPSPS信号。对水稻不同发育时期代表性组织的检测结果表明,CP4-EPSPS蛋白质呈组成型表达,在花药、穗轴、颖壳及不同时期的叶片中的表达量较高,但在分蘖期基部茎节、叶鞘及成熟期种子胚中的表达量稍低。本研究建立的免疫学方法在转基因水稻检测中具有潜在的应用价值。     

植物基因印迹及其对种子发育的影响

基因印迹最先发现于哺乳动物的胚胎发育中,近些年研究表明也存在植物种子发育中.基因印迹成为当前植物种子发育生物学的研究热点.从印迹基因、印迹机制及其对植物种子发育的影响等方面综述了植物种子发育中基因印迹的研究进展,并提出研究中存在的问题及其解决对策,旨在为今后相关研究提供参考.