A群猪轮状病毒JS株vp7基因序列分析

根据已发表的猪轮状病毒OSU毒株vp7基因核苷酸序列ORF两端保守区序列,设计一对特异引物,以猪轮状病毒JS毒株反转录cDNA为模板,通过PCR方法扩增出长约1000 bp目的片段。将其进行T-A克隆、序列测定和分析。结果表明,vp7基因全长1062 bp,含有一个981 bp的开放阅读框,编码326个氨基酸。与已知的15个毒株vp7全长基因的核苷酸及推导的氨基酸序列比较,同源性分别为74.5%～78.5%和75.2%～83.1%,核苷酸系统发育进化树结果表明,JS毒株与轮状病毒G9型参考毒株ICB2185、O-1亲缘关系较近,分为一个群,表明JS毒株血清型为G9型。目前,我国尚未见猪及其它动物轮状病毒G9型流行株的报道。     

猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪传染性胃肠炎病毒和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法。同时对37份现地病料进行检测并与常规RT-PCR方法、TGEV抗原快速检测试剂盒比较。结果,该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性,而常规RT-PCR方法只能检测到1.53×103拷贝/μL。对37份现地病料的检测结果也表明该法(检出17份)比常规RT-PCR方法(检出12份)和TGEV抗原快速检测试剂盒(免疫层析法,检出10份)的敏感性高。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白核仁定位信号对宿主细胞周期的影响

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与宿主细胞相互作用,本研究根据前期已经鉴定的PEDV N蛋白核仁定位信号序列,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法扩增出核仁定位信号序列缺失的PEDV N基因(dN),并将其与真核表达载体pAc-GFP-C1连接,构建重组质粒pAc-GFP-dN。将pAc-GFP-dN转染于Vero E6细胞中,利用激光共聚焦显微镜分析重组质粒pAc-GFP-dN表达蛋白的定位情况,并利用流式细胞仪检测转染细胞的周期变化。实验结果表明:与完整的N蛋白相比,缺失核仁定位信号的N蛋白不能定位于细胞核仁,同时丧失了使宿主细胞周期在G2/M期停滞的能力,从而揭示了N蛋白核仁定位信号对宿主细胞具有重要的影响。     

A群猪轮状病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

To prepare the monoclonal antibodies against VP7 protein of group A porcine rotavirus (PoRV) serotype G11,VP7 gene of PoRV serotype G11 was cloned into the vector pGEX-6P-1. The recombinant plasmid was transformed into E.coli competent cells DH5α and induced by IPTG. Hybridomas were produced by fusing SP2/0 cells with spleen cells from mouse immunized with GST-VP7 recombinant protein. One hybridomas secreting MAb against VP7 protein was identified by indirect ELISA. Western blotting analysis showed that the MAb could recognize the recombinant VP7 protein and authentic VP7 protein of PoRV，and the specific immunoflurescence was detected in PoRV infected MA104 cells by indirect immunoflurescence assay.The result of MTT method showed that the MAb had the neutralizing activity. The subtype of the MAb was IgG2b. The results showed that VP7 protein was successfully expressed in E.coli， one MAb was preparated and identified，and it could be used for further study of prevention，diagnosis and treatment of porcine rotavirus disease.     

猪圆环病毒Ⅱ型引起的断乳仔猪全身性消瘦综合征

猪圆环病毒(PCV)主要侵犯机体的免疫系统,可引起断奶仔猪全身性消瘦综合征(PMWS),其临床症状主要表现为进行性呼吸困难,消瘦,体表淋巴结肿大,腹泻,黄症,贫血,导致死亡.     

猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白抗原间接ELISA抗体检测方法的建立

本研究以纯化的原核表达猪传染性胃肠炎病毒N蛋白为诊断抗原，建立了猪传染性胃肠炎病毒抗体检测的间接ELISA诊断方法，将其命名为mTGE-ELISA。该抗原不与其他常见10种猪病的阳性血清发生交叉反应。批内和批间重复性试验的变异系数均小于15％；对仔猪免疫后不同时间的血清检测结果表明mTGE-ELISA与纯化病毒ELISA符合率达95．0％；mTGE-ELISA相对于VN试验的敏感性为96．3％、特异性为92．2％：现地试验中，mTGE-ELISA与Svanova TGEV／PRCV antibody diagnosis Kit的符合率达87．0％，通过中和试验复核结果表明，mTGE-ELISA的假阳性低于Svanova TGEV／PRCV antibody diagnosis Kit。本试验建立的mTGE-ELISA诊断方法具有良好的敏感性和特异性，为免疫猪群抗体监测和TGE流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

A群轮状病毒NSP5蛋白在细胞器中定位特性

为研究A组猪轮状病毒(Po RV)非结构蛋白NSP5在MA-104细胞中的定位情况,本研究将NSP5蛋白基因克隆于表达载体p EGFP-C2中构建重组质粒p EGFP-NSP5,将其转染于MA-104细胞中进行NSP5瞬时表达,并于转染48 h后利用激光共聚焦显微镜分析NSP5表达蛋白在细胞中的定位情况。结果表明,表达蛋白在MA-104细胞中的线粒体、内质网、高尔基体中均有分布,主要定位于细胞质。本研究为进一步分析病毒的复制和致病机理提供依据。     

抗猪SIgA SC片段单克隆抗体的制备及鉴定

为获得抗猪分泌型IgA(SIgA)的单克隆抗体(MAb),本研究以纯化的SIgA蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出1株稳定分泌抗SIgA SC片段的杂交瘤细胞株,命名为2F9。MAb亚类鉴定结果显示其亚类为IgG1/κ链。杂交瘤细胞培养上清液和腹水的效价分别为1∶200和1∶16 000。Western blot鉴定显示该MAb能够识别天然SIgA蛋白;IFA显示该MAb可以识别真核细胞表达的SIgA SC蛋白。抗猪SIgA SC片段的MAb制备,为建立一系列猪消化道病原的特异性SIgA诊断方法及研究黏膜免疫提供了重要工具,具有广阔的应用前景。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达及其亚细胞定位的初步分析

以构建的含有编码猪流行性腹泻病毒CV777株核衣壳蛋白（N）基因的阳性质粒pMDT-18-N为模板,用含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点的上、下游引物扩增获得N基因,该PCR产物经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到经相同双酶切的真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,经过酶切鉴定和测序鉴定,将构建的重组质粒命名为pcD-NA3.1（＋）-N,且未发现碱基的缺失和插入。用脂质体法将pcDNA3.1（＋）-N转染Vero E6细胞,在48 h后,以针对猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白的鼠源多抗血清进行Western blot、免疫荧光检测,并运用共聚焦显微镜分析N蛋白的亚细胞定位。结果表明N基因能在真核细胞Vero E6中正确表达,共聚焦分析结果表明N蛋白在细胞质和细胞核中定位。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合域的分析

以猪流行性腹泻病毒（PEDV）可溶性的猪氨基肽酶N受体为靶蛋白对PEDV S1基因特异性肽库进行3轮生物淘选,然后对30个淘选的噬菌体克隆进行测序。序列分析发现,2个噬菌体克隆展示无义氨基酸序列,其余28个噬菌体克隆展示的氨基酸序列位于PEDV S蛋白的第249-529位氨基酸区域,这个区域被命名为MRR。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对MRR基因进行真核表达。Western blot结果表明,表达的MRR重组蛋白能够与兔抗PEDV多克隆抗体反应。