一例猪繁殖与呼吸综合征的RT-PCR诊断与防制

2008年3月,新乡市某猪场发生了以一种经产母猪和初产母猪流产、死产、产木乃伊胎、死胎及弱仔为特征的疾病。采集流产胎儿和死胎的肺、肝、脾脏等病料,制悬液,取上清,进行细胞培养,观察细胞病变。另根据猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株VR-2332 ORF7基因序列设计一对特异引物,提取流产胎儿的肺、肝等组织中PRRSV的RNA,经RT-PCR扩增,检测猪繁殖与呼吸综合征病毒为阳性,结合病史和临床症状,诊断为猪繁殖与呼吸综合征。通过对该猪场采取紧急接种疫苗、彻底消毒等综合防制措施,控制了该病的流行与蔓延。     

H1N1亚型猪流感病毒SW/HN/405/10株神经氨酸酶基因来源的探究

为了研究H1N1亚型猪流感遗传演化与变异的特性,2010年2月从河南省某发病猪场采集疑似猪流感的病猪鼻拭子,通过鸡胚尿囊腔传代接种法分离病毒,利用血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)及RT-PCR方法对病毒分离株进行鉴定,并对分离株的NA基因进行了序列扩增及遗传进化分析。结果表明：分离到一株H1N1病毒,命名为A/swine/Henan/405/2010(H1N1)(SW/HN/405/10);同源性分析结果发现：分离毒株NA基因与GeneBank中登录的类禽型H1N1流感病毒代表株有较高的同源性(92.1%~99.4%),与A /swine/ Hong Kong/ NS62 /2005的同源性最高;NA核苷酸序列分析发现：没有核苷酸插入或缺失,其酶活性中心,二硫键及糖基化位点高度保守,但抗原位点有变异;系统进化树分析发现：该分离株的NA基因与类禽型H1N1猪流感病毒进化关系最近且处于同一分支上。由此推测该分离株NA基因可能来源于类禽型H1N1猪源谱系,遗传特征相对稳定,但同时也发生了一定的变异,说明该分离株还在不断地变异和演化。     

鸡新城疫—传染性支气管炎—禽流感(H9N2)三联灭活疫苗的安全性研究

为证实鸡新城疫—传染性支气管炎—禽流感(新支流)三联灭活油乳疫苗的安全性,通过颈部皮下注射接种14日龄来航鸡,每日测定鸡的体重,连续监测28 d,用t检验分析对照组和免疫组体重之间的差异显著性。试验结果表明,免疫接种组和空白对照组体重差异不显著,所制备的新支流三联疫苗不影响鸡的生长性能,对鸡安全。     

一株致仔猪关节炎粪肠球菌的鉴定

对1株分离自关节炎病仔猪的肠球菌进行鉴定。选用常规方法进行染色特性、培养特性观察以及药物敏感性和致病试验,然后利用Vitek-32全自动细菌鉴定系统进行生化特性鉴定,并用PCR方法扩增分离株的16 S rRNA基因,克隆并测序,与GenBank上登录的相关菌株及3个粪肠球菌标准菌株进行16 SrRNA序列比较、同源性分析并构建系统发育树。结果显示,该分离株形态及染色特性与肠球菌一致,对仔猪具有一定的致病性,并对临床常用的7种药物产生了耐受性;Vitek-32生化鉴定和16 S rRNA基因同源性分析及比对结果均显示其为粪肠球菌(E.faecalis)。试验证实了粪肠球菌可导致仔猪关节炎。     

猪源粪肠球菌和屎肠球菌多重PCR快速鉴定方法的建立

粪肠球菌和屎肠球菌是引起猪感染发病的优势肠球菌种,以肠球菌的16 S rRNA基因设计属特异性引物,利用SodA基因多态性设计种特异性引物,同时优化反应条件,建立了能同时测定猪源粪肠球菌和屎肠球菌多重PCR方法。通过对来源于猪的临床菌株、粪便菌株和鲜猪肉菌株进行测定,均能成功扩增出属特异性片段和种特异性片段。经过与快速生化鉴定试剂盒(Vitek-32)和16 S rRNA测序方法比较,多重PCR与16 S rRNA测序方法对猪的临床菌株、粪便菌株和鲜猪肉菌株的鉴定符合率100%;与Vitek-32鉴定符合率为62.3%,其中,与分离于感染猪的临床菌株符合率仅有46.7%,特别是感染猪的屎肠球菌,符合率仅为22.3%。     

地方品种固始鸭与樱桃谷鸭α-干扰素基因的克隆与遗传进化分析

根据GenBank发表的鸭α-干扰素(interferon-alpha,IFN-α)基因序列(AY879230),设计并合成了1对引物,提取固始鸭和樱桃谷鸭基因组DNA,应用PCR技术扩增地方品种固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因,并克隆、测序.测序结果表明获得了固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因,大小均为584 bp,包含1个IFN-α基因完整的开放阅读框,编码191个氨基酸的多肽.推导的氨基酸有2个潜在的 N-糖基化位点,有7个与二硫键形成有关的半胱氨酸.克隆的固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因与北京鸭IFN-α基因的氨基酸序列比较,仅固始鸭IFN-α基因发生突变D38N.固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因与其他IFN-α基因的氨基酸序列遗传进化树分析表明樱桃谷鸭与北京鸭有很近的亲缘关系,固始鸭次之.地方品种固始鸭在非常保守的38位发生了氨基酸突变,推测这可能与该品种鸭具有很强的抗病能力有关.     

基于TaqMan探针的猪细小病毒实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank公布的猪细小病毒VP2基因序列,利用Premierexpress软件设计并合成了1对引物和1条相应的TaqMan探针,从猪细小病毒感染的PK．15细胞中提取DNA,经PCR扩增VP2基因,纯化的PCR产物克隆入pGEM-TEasy载体中,构建重组质粒．转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为荧光定量PCR标准品模板建立标准曲线．在25此扩增反应体系中,对探针浓度、引物浓度、镁离子浓度和退火温度进行优化,建立了最佳的荧光定量PCR反应体系和扩增程序．该方法能够特异、定量检测猪细小病毒,灵敏度达1．12TCID50／mL．     

EDSV HN03株纤维蛋白基因的克隆与序列分析

【目的】研究减蛋综合征病毒(EDSV)河南HN03株纤维蛋白基因全序列,为进一步分析EDSV纤维蛋白基因的结构、功能以及EDSV基因工程疫苗的研究奠定基础。【方法】根据GenBank中收录的EDSV纤维蛋白基因序列(Z86065),设计并合成了1对引物,PCR扩增EDSV河南HN03株纤维蛋白基因。将扩增产物克隆入pTG19-T载体并测序。【结果】测序结果表明,HN03株纤维蛋白基因为1935 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码644个氨基酸,推导的氨基酸序列有5个潜在的N-糖基化位点,有5个与二硫键形成有关的半胱氨酸。序列分析表明,EDSV HN03株与EDSV国际标准株AV-127纤维蛋白基因核苷酸同源性为99.3%,氨基酸同源性为99.2%;与鹌鹑腺病毒QU株纤维蛋白基因核苷酸同源性为98.9%,氨基酸同源性为98.4%。【结论】腺病毒纤维蛋白基因相当保守。     

H9亚型禽流感病毒血凝素基因重组禽痘病毒的构建

【目的】获得表达H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组禽痘病毒。【方法】将含禽痘病毒启动子LP2EP2驱动的HA基因,插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组转移载体pSY681/HA。用脂质体将其转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达HA的重组禽痘病毒rFPV-HA。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选后,对重组病毒进行多次蚀斑克隆,并用间接免疫荧光法对感染重组病毒鸡胚成纤维细胞中HA的表达产物进行鉴定。【结果】以重组禽痘病毒DNA为模板,利用HA基因特异引物进行PCR,扩增出1条约1.7 kb左右的带。以间接免疫荧光法证实重组禽痘病毒能表达HA。【结论】成功构建了表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组禽痘病毒,且构建的重组禽痘病毒能表达具有生物学活性的HA。     

板蓝根多糖的提取及其对猪细小病毒的体外作用

用水煮醇沉法提取板蓝根多糖,通过观察PK-15细胞病变效应（CPE）来评价板蓝根多糖的不同加药方式体外对猪细小病毒（PPV）的阻断和抑制作用。结果表明板蓝根多糖在对细胞的安全浓度范围内,对猪细小病毒有明显的阻断作用和抑制的作用,最小的阻断浓度为2.09μg/ml,最小的抑制浓度为4.19μg/ml。