10株不同年代H9N2 AIV NA基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术克隆了10株涵盖不同分离年代和不同毒力的H9N2亚型AIV的NA基因,序列分析表明,10株AIV的NA基因的核苷酸和推导的氨基酸同源性高,进化稳定。系统进化树分析表明,其NA基因都属欧亚大陆禽分支,H9N2流感病毒的分布与地域有相关性。其NA蛋白氨基酸序列潜在的糖基化位点以及氨基酸红细胞吸附位点出现的变化尚不能解释这些毒株生物学特性上的差别。但这些研究结果从理论上丰富了H9N2亚型禽流感的分子流行病学,也为进一步研究该类毒株的进化提供了依据。     

H9N2亚型禽流感安徽分离株CK/AH/1/10的分子特征

为了了解H9N2亚型禽流感病毒安徽分离株CK/AH/1/10基因组的分子特征,本研究采用RT-PCR方法扩增了CK/AH/1/10分离株8个片段的基因,克隆测序后进行同源性比较及遗传进化分析。结果显示:分离株CK/AH/1/10 HA蛋白的裂解位点为低致病性禽流感病毒,参照Guan等[4]对H9亚型禽流感病毒HA基因的分类标准,可将CK/AH/1/10株归属于欧亚系G9-like亚分支。     

2009年山东H9N2亚型禽流感M基因的分子进化分析及对哺乳动物致病性的研究

根据GenBank公布的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)M基因序列设计引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增H9N2亚型禽流感病毒M基因,并与GenBank中AIV M基因序列进行了同源性比较和氨基酸编码分析,绘制了M基因的系统发育进化树。结果表明：这6株病毒的M基因的核苷酸同源性在95.9-99.4%。M1蛋白的同源性在97.6-99.6%。M2蛋白的同源性在95.1-100%。进化分析这6株病毒都属于A/Quail/Hong- Kong/G1/97 (G1)-like 分支。这6株病毒的M2蛋白的第31位氨基酸存在S→N（AGT→AAT）的变异,都具有金刚烷胺的抗性。以106 EID50 的剂量,将H9N2 病毒鼻腔感染BALB/c 小鼠,结果表明H9N2 亚型流感病毒可以对哺乳动物小鼠可使得体重下降,也可致死。.本研究结果对于揭示H9N2 亚型禽流感流行规律和病毒的致病机理具有一定的意义。     

产蛋异常蛋鸭H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

从表现产蛋异常的蛋鸭中分离到1 株病毒, 经血凝抑制试验（HI）和聚合酶链反应（PCR）方法鉴定为H9N2亚型禽流感病毒。在GenBank中,BLAST分析扩增的该病毒3个基因片段表明,该株病毒与96年我国山东鸡H9N2亚型禽流感病毒(A/chicken/Shandong/6/96(H9N2))各相应的基因片段同源性最高,均为99%,所扩增的3个片段均为禽源H9N2亚型禽流感病毒的相应基因片段。对HA基因的遗传进化分析表明,该病毒与参考毒株（A/CK/BJ/94）处于同一进化分支上。     

高抗体水平肉种鸡H9N2的分离鉴定及HA基因序列分析

从抗体水平较高、产蛋下降的种鸡群分离到一株具有血凝特点的病毒,经HI交叉抑制试验证实为H9N2病毒,命名A/Chicken/Shandong/LY/08,病毒对SPF鸡无致病性,IVPI为0。对其HA基因进行克隆测序,HA基因氨基酸裂解位点的基序为RSSR↓GL,与弱毒基序一致。A/chicken/Shandong/LY/08分离毒株与GenBank上发表的山东参考株HA基因的核苷酸之间的同源性为95.2%～99.6%,氨基酸序列之间的同源性为95.4%～99.5%。与国外A/ck/Korea/ms96/96、A/Parakeet/chiba/1/97和A/turkey/Wisconsin/1/1966 HA基因核苷酸序列同源性为82.6%～91.6%,氨基酸序列同源性为87.9%～92.2%。系统进化树分析表明,该毒株与近年来国内流行的H9N2禽流感毒株类似。     

猪嵴病毒福建株结构蛋白VP 基因的克隆与生物信息学分析

为丰富猪嵴病毒结构的分子流行病学数据,明确福建株猪嵴病毒结构蛋白VP的特征,研究运用RT-PCR方法设计特异性引物,对猪嵴病毒结构蛋白进行分段扩增后进行克隆测序,并将测序结果进行拼接后进行生物信息学分析。结果表明,所扩增福建株猪嵴病毒含有完整的结构蛋白VP,其基因全长为2529 bp,编码有843个氨基酸,理论等电点为5.34,理论分子质量为89.603 kD,不稳定系数为37.71,最大疏水指数为2.522,最小疏水指数为-2.622。其和XX株猪嵴病毒结构蛋白核苷酸同源性最高,仅为86.7%,与swine/S-1-HUN/2007/Hungary株猪嵴病毒结构蛋白核苷酸同源性最低,为83.7%。从遗传进化上看,猪嵴病毒结构蛋白在遗传进化上呈现2个独立的分支,中国猪嵴病毒分离株在2个遗传分支上均有分布。     

硫酸酯化酵母β-葡聚糖对H1N1猪流感病毒血凝作用和mRNA转录的影响

为研究硫酸酯化酵母β-葡聚糖对流感病毒血凝抑制作用及对mRNA转录的影响,以猪流感病毒A/tianjin/1/TJ2(H1N1)感染MDCK细胞为模型,采用血凝抑制试验(HI)及SYBR Green Real-time PCR方法,探索硫酸酯化酵母β-葡聚糖对流感病毒血凝抑制作用及其对mRNA转录影响。结果显示,硫酸酯化酵母β-葡聚糖在浓度超过1.25 mg/m L时,能对猪流感病毒血凝产生抑制作用,且在5 mg/m L时对猪流感病毒mRNA转录具有抑制作用。因此,硫酸酯化酵母β-葡聚糖具有抑制流感病毒在MDCK细胞复制的作用,其作用机制可能与抑制流感病毒HA靶点及影响mRNA转录有关。     

洞庭湖区H10亚型禽流感监测及其遗传进化分析

为了解洞庭湖区H10 亚型禽流感病毒的流行分布及遗传进化情况,为该地区H10 亚型禽流感的防控及该亚型病毒在禽流感病毒进化中所起的作用提供一些参考。在环洞庭湖地区活禽批发市场和水禽场上采集家禽和环境拭子,对其进行病原分离、鉴定和测序,应用Mega 5 软件包对病毒基因进行多序列比对和进化树的绘制与分析。结果显示：在活禽批发市场上总共分离到11 株H10 亚型禽流感病毒,分离的H10 亚型禽流感阳性样品全来源于鸭拭子;在1 个鸭场分离到2 株H10 亚型禽流感病毒;其中2株分离毒株序列分析显示其HA蛋白的裂解位点为PELMQGR/GLF,属于低致病性病毒,与以往在其他国家（蒙古、瑞典、荷兰、泰国、日本等）野鸟中分离的H10亚型病毒处于同一分支。     

猪流行性腹泻病毒山西分离株ORF3基因序列分析

为了研究山西地区猪流行性腹泻病毒ORF3基因的遗传变异情况,2014-2015年从山西地区11个地市收集的PEDV阳性病料中扩增到4株PEDV的ORF3基因,并进行序列比对及遗传分析。序列分析结果表明,4株PEDV山西分离毒株的ORF3基因与CV777毒株相比,无核苷酸插入和缺失,有部分核苷酸及氨基酸发生变异;4株PEDV山西分离毒株的ORF3基因之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.6%~100.0%和98.7%~99.6%,与CV777、疫苗株CV777 truncated和attenuated DR13核苷酸同源性分别为96.6%~97.0%,90.6%,97.6%~98.1%,氨基酸同源性分别为95.1%~96.0%,88.0%,97.1%~98.1%。遗传进化分析结果显示,4株PEDV山西分离毒株与12株2010-2015年我国各地方分离的毒株和2009年分离的CH/JL/09毒株亲缘关系较近;与CV777、LZC、Brl/87和2个疫苗株(CV777truncated和attenuated DR13)亲缘关系较远。     

犬瘟热病毒疫苗免疫逃逸株的血凝素基因变异研究

为了弄清是否有新基因型犬瘟热病毒出现,对山东省不同地区的免疫水貂、狐狸和犬进行了犬瘟热病毒检测,扩增了病毒核衣壳基因和血凝素基因(H),并对13个犬瘟热病毒山东株(8株貂源,2株狐狸源,3株犬源)血凝素基因进行了测序。结果表明,13个犬瘟热病毒山东株之间H基因核苷酸同源性为99.1%~100.0%,均为Asia-1型,这也是我国目前水貂犬瘟热病毒唯一的基因型。与2012年之前的犬瘟热病毒中国分离株及疫苗株相比,13个毒株H基因有4个氨基酸的一致性变异,即P200S、M263I、I542N和Y549H,N-糖基化位点比Onderstepoort株多6或7个,比CDV3株多3或4个。抗原性分析表明,与疫苗株相比,13株山东株在540-549位氨基酸出现一个新的抗原区域,210-230,327-347位的抗原区域也与疫苗株不同,这些变异可能是我国貂狐犬瘟热免疫失败的原因。     

新城疫病毒La Sota株HN基因的克隆与序列分析

旨在从分子生物学角度进一步研究新城疫病毒La Sota株HN基因,探究NDV La Sota HN基因的遗传变异情况。研究以试验室冻存的p NDV-HN为模版,根据Gen Bank中登录的NDV La Sota株序列设计引物扩增HN基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒p MD-NDV-HN进行测序分析。应用生物信息学软件对新城疫病毒Lasota株HN基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、糖基化位点、蛋白结构跨膜区分析及磷酸化位点预测分析。核苷酸序列测定结果表明:HN基因的序列长度为1743bp,该基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)总长为1716 bp,编码571个氨基酸。生物信息学表明:试验获得的HN基因具有6个潜在糖基化位点及12个半胱氨酸残基,第5个潜在糖基化位点(508-510 aa)发生缺失及第123位半胱氨酸残基被色氨酸残基取代。La Sota株HN基因编码的蛋白质中有29个丝氨酸、10个酪氨酸和16个苏氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化位点。将试验获得的La Sota株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现,它们的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高均可达到99%,表明HN基因在种属间具有较高的保守性。研究为新城疫病毒的分子病毒学研究奠定了基础。     

CSFV,SIV,PCV2,PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)基因序列,设计了5对引物分别用于扩增CSFVE2、SIV、PCV2ORF2、PRVgB、PRRSVN基因的目的片段。通过对反应条件进行优化,建立了检测CSFV、SIV、PCV2、PRV和PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法。敏感性和特异性结果显示,该mPCR对5种病毒的最低核酸检测量为10pg。而对大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、猪细小病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒的多重PCR的扩增结果均为阴性。临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对SIV、CSFV、PCV2、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。     

2010-2011年河南省部分地区H9亚型禽流感、新城疫

为了解河南省H9亚型禽流感、新城疫和鸡传染性支气管炎的流行情况。从河南省15个地市发病鸡场采集病鸡组织样品309份,采用鸡胚尿囊腔传代接种法分离病毒,并利用血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)和RT-PCR试验对分离毒株进行鉴定。结果表明,3类病毒的总检出率为26.54%,其中NDV、IBV和AIV(H9)的检出率分别为11.00％、3.88％和11.65％。2010年10月NDV和IBV检出率均最高,分别为30.00％、15.00％,2011年1月AIV(H9)检出率最高,为43.24％。2类病毒混合感染的检出率达3.24％。表明2010年7月-2011年4月H9亚型禽流感、新城疫以及鸡传染性支气管炎在河南省部分地区普遍流行,且存在一定程度的混合感染。为有效预防和控制河南省3种主要疫病提供了科学依据。     

RT-PCR技术检测猪流感病毒

根据猪流感病毒（SIV）的M基因的序列,设计合成了1对引物,建立了检测猪流感的RT-PCR方法。应用该方法对H1、H3、H9亚型的猪流感病毒进行基因扩增,均获得了分子量为460bp的特异性目的片段,而对PRRSV、 PCV2、PRV、CSFV进行同条件检测,结果均为阴性;SIV扩增产物测序结果与SIV其他毒株序列同源性达99%～100% 。敏感性试验表明,该方法可检测到103 EID50的SIV;可直接从猪流感病毒感染小鼠的组织样品中检测到病毒。     

H5亚型高致病性禽流感病毒的全球传播与进化

旨在研究H5 亚型高致病性禽流感病毒的暴发、传播及进化规律，探索不同宿主、宿主行为、地理环境等因素对疾病传播与进化的影响，以期为该疾病未来预防与控制提供建议和理论支持。研究中利用空间分析技术、系统进化分析技术，研究了全球H5 亚型高致病性禽流感疫情（2004—2015 年）的时空爆发、传播和进化规律。结果表明：H5 亚型高致病性禽流感病毒在2004—2008 年出现集中暴发及大面积扩散后，于2011—2015 年出现第二次大面积暴发，同时伴随多种禽流感亚型。此外，对不同地区病毒的遗传差异进行分析，发现地理隔离会造成病毒在区域内鲜有进化或暴发；而病毒在一个地区持续性存在并感染不同宿主，导致病毒的进化及遗传的多样性。研究认为，地理隔离、宿主行为等因素是造成有些地区如南亚、北美洲，病毒遗传差异较小，而有些地区如东北亚、中国等病毒的遗传差异显著的原因之一。     

鸡传染性法氏囊病病毒的分离鉴定与培养特性研究

为研究鸡传染性法氏囊病病毒在不同宿主上的培养特性,从河南省某疑似感染鸡传染性法氏囊病病毒的鸡场采集病料,通过琼脂免疫扩散试验初步筛选出IBDV毒株,并将毒株回归易感鸡,在SPF鸡胚及DF1细胞上培养。结果显示：培养出的病毒作为抗原与标准阳性血清之间均出现阳性沉淀线;回归SPF鸡试验显示发病率达100%,死亡达60%,病死鸡只出现法氏囊肿大、出血甚至出现紫葡萄样;该毒株能引起鸡胚CAM增厚、胚体出血,引起DF1细胞变圆脱落;ELD50与TCID50分别为10-4.6/0.1 mL、10-5.5/0.1 mL。试验证实IBDV分离株,属于超强毒株,该毒株可以在鸡胚和DF1细胞上适应增殖,将其命名为HN12号分离株。     

H5N1型禽流感病毒HA基因克隆及序列分析

为从分子生物学角度进一步研究H5N1型禽流感主要抗原HA基因,探究H5N1 HA基因的遗传变异情况及其蛋白结构,根据GenBank中登录的H5N1型禽流感HA基因的序列利用Primer 5.0设计引物扩增HA基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒pMD-H5N1-HA进行测序分析。应用生物信息学软件对禽流感病毒HA基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、保守区分析,磷酸化位点和序列重复区分析及HA蛋白二级、三级结构的预测。核苷酸序列测定结果表明：HA基因长1661 bp,共编码326个氨基酸;生物信息学分析结果表明：HA基因在种间具有较高保守性,HA基因的氨基酸序列与其他地方性禽流感H5N1病毒株HA基因的序列同源性最高可达99.7%,且为高致病性毒株;HA蛋白的二级、三级结构预测结果显示：HA蛋白多为α螺旋和β转角结构,无规则卷曲,是亲水性蛋白。该结果为禽流感病毒的分子病毒学研究奠定了基础。     

猪流感H3N2亚型HA 基因真核表达载体构建及其对小鼠的免疫效果的研究

采用PCR方法扩增出猪流感病毒四川分离株H3N2亚型HA全基因,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,成功构建出真核重组质粒pcDNA3.1-HA.采用纯化后的pcDNA3.1-HA质粒和灭活全病毒以不同的组合免疫4～6周龄的Balb/c小鼠,免疫2次间隔3周,加强免疫3周后,小鼠接种致死量的H3N2病毒;检测免疫后小鼠的血清抗体水平及攻毒后肺部病毒残留.结果表明,pcDNA3.1-HA质粒和灭活全病毒免疫小鼠后,均能够产生一定的免疫效果,能为小鼠提供H3N2亚型猪流感病毒保护.