南美蟛蜞菊WtActin1基因克隆及表达稳定性分析

[目的]克隆南美蟛蜞菊肌动蛋白基因(WtActin1),并进行生物信息学及表达稳定性分析,为南美蟛蜞菊耐热耐冷功能基因表达及调控研究提供可靠的内参基因.[方法]RACE克隆WtActin1基因,通过在线生物信息学分析软件对其氨基酸序列进行分析,并利用实时荧光定量PCR检测该基因在不同组织及温度胁迫下的表达情况.[结果]克隆获得的WtActin1基因cDNA全长1682 bp(GenBank登录号MN485900),其中5'非编码区(5'-UTR)170 bp,3'非编码区(3'-UTR)378 bp,开放阅读框(ORF)1134 bp,编码377个氨基酸残基.WtActin1蛋白分子量为41725.81 Da,理论等电点(pI)为5.31,不稳定性指数(II)为37.48,亲水性的平均值(GRAVY)为-0.166,为稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构域和无信号肽,主要存在于细胞质中,具有Actin蛋白家族的典型特征结构,其二级结构主要由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成,三级结构同源模型为嵌合肌动(3ci5.1.A),与莴苣、橡胶草和洋蓟的同源蛋白三级结构高度相似.WtActin1基因与其他植物Actin基因核苷酸序列相似性在86.4%以上,其推导氨基酸序列相似性在94.0%以上.从基于Actin氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树可看出,WtActin1与同为菊科的莴苣LsActin7亲缘关系最近,与传统分类学相吻合,其次是菊科的橡胶草TkActin1和锦葵科的棉花GhActin.WtActin1基因在南美蟛蜞菊根、茎、叶和花中的表达量均无显著差异(P>0.05,下同),且在高、低温胁迫下与正常温度处理的表达量也均无显著差异.[结论]WtAtin1基因属于Actin基因家族成员,在不同组织及温度胁迫下均能稳定表达,可作为内参基因用于南美蟛蜞菊耐热耐冷功能基因研究.     

水稻3-磷脂酰肌醇激酶FAB1/PIKfyve基因家族的鉴定及功能分析

FAB1/PIKfyve是催化3-磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns3P)形成3,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns(3,5)P2)过程的关键酶,其产物PtdIns(3,5)P2在真核细胞发育中发挥重要功能.为探寻PtdIns(3,5)P2在水稻生殖发育过程中的功能,本研究结合生物信息学和遗传学方法,对水稻FAB1/PIKfyve基因进行鉴定,分析其理化性质、基因结构、保守结构域、系统进化、顺式作用元件和组织表达模式并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得osfab1b突变体.生物信息学分析结果显示,水稻基因组中共鉴定到9个FAB1基因家族成员;基因结构分析显示FAB1家族基因结构存在差异,外显子数量为8～12个;保守结构域分析表明仅OsFAB1A和OsFAB1B含有N端FYVE结构域,其余成员具有Cpn60_TCP1结构域和PIPKc激酶结构域;系统进化分析提示FAB1家族功能在单双子叶植物中具有高度保守性;FAB1基因上游调控区域顺式元件预测发现多种生长发育相关、光响应以及激素和胁迫响应顺式元件;组织表达模式分析显示大多数FAB1基因为泛表达,其中FAB1C亚类基因在内外稃中的高表达提示其可能参与花器官发育.最后通过CRISPR/Cas9系统得到osfab1b突变体,经碘染观察花粉活力无明显异常,暗示FAB1家族在水稻生殖发育调控中存在功能冗余.本研究结果为单子叶模式植物水稻中磷脂酰肌醇调控网络及其生物学功能的研究提供了理论参考.     

山羊TNNT3基因可变剪切及其对骨骼肌细胞分化的作用

【目的】快速骨骼肌肌钙蛋白T（fast skeletal troponin T3,TNNT3）作为肌钙蛋白(troponin, Tn)家族成员,调节横纹肌收缩、参与骨骼肌的生长发育并影响家畜肉质性状。通过获得山羊TNNT3基因的可变剪切体,分析山羊TNNT3基因可变剪切的表达模式及其在肌细胞分化中的作用,深入解析TNNT3基因在山羊骨骼肌生长发育过程中的作用机制。【方法】基于NCBI已公布山羊TNNT3基因（NM_001314210.1）和牛TNNT3基因（XM_010821200）mRNA序列,使用软件Primer Premier 6.0设计引物,以简州大耳羊胚胎期和出生后7个阶段骨骼肌为试验材料,克隆测序获得山羊TNNT3基因的CDS区可变剪切体,利用软件ORF Finder、EditSeq、DNAMAN、ClustalW和MEGA_X_10.1.8等对序列进行生物信息学分析;进一步设计实时荧光定量（real-time PCR,RT-qPCR）及半定量引物,研究TNNT3基因剪切体在7个不同组织（背最长肌（longissimus dorsi muscle,LD）、半膜肌（semimembranosus muscle,SM）、心、肝、脾、肺、肾）和7个发育阶段（胚胎期E75、E90、E105和出生后B3、B45、B150、B300）肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中表达模式;此外,对转录本TNNT3_3进行体外编码能力检测确定其具有编码蛋白的能力,并在山羊骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cells,MuSCs）中过表达,观察细胞形态变化以及检测标志基因的表达变化,研究其对山羊MuSCs分化的作用。【结果】①TNNT3（NM_001314210.1）CDS区全序列主要含有18个外显子,其中外显子16/17相互排斥,转录后单一表达。克隆发现山羊TNNT3基因 5个新转录本（TNNT3_1—5）,其外显子数分别是15、15、20、16、14。②生物信息学分析结果显示山羊TNNT3基因核苷酸序列和氨基酸序列与绵羊、牛、猪等哺乳动物具有很高的一致性,而与鱼类和爬行类动物的一致性较低,说明TNNT3基因序列在哺乳动物高度保守。③TNNT3 mRNA在背最长肌、半膜肌、心、肝、脾、肺、肾7个组织中都有表达,其中在骨骼肌中高度富集(P < 0.01),心脏及肺次之,其余组织中较低;TNNT3 mRNA在背最长肌和半膜肌中的表达始终处于一个动态变化中,胚胎期TNNT3在半膜肌的表达量高于背最长肌（P<0.05）;出生后则背最长肌中高于半膜肌（P<0.05）。④山羊TNNT3基因转录本TNNT3_3重复出现保守的外显子9—11（138bp）,体外翻译实验显示其可编码蛋白且蛋白大小与预期基本相符（37 kD）;相较于对照组,在山羊MuSCs中过表达该转录本使肌分化标志基因Myomaker、MyoG和MyH4 mRNA极显著升高(P < 0.01)。【结论】获得了山羊TNNT3基因具有完整CDS区5个新可变剪切体,TNNT3主要在肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中高表达,在哺乳动物中高度保守且促进成肌分化。初步表明TNNT3基因在动物肌肉生长发育中具有重要的生物学功能。     

茶叶中EGCG改善肥胖大鼠肠黏膜屏障损伤的作用研究

为探究EGCG对高脂诱导肥胖大鼠肠黏膜屏障损伤的保护作用,将雄性SD大鼠随机分为正常组、肥胖组、EGCG低剂量及高剂量干预组,每组8只.通过分析大鼠的体重、血清指标、脏器指数及脂肪组织病理切片评估肥胖大鼠脂质聚集与炎症状况及EGCG的干预作用.通过分析肠道病理切片、绒毛长度/隐窝深度值(V/C值)以及血清中脂多糖(LPS)水平和二胺氧化酶(DAO)活力评估肠道的通透性和完整性;通过分析血清肿瘤坏死因子(TNF-α)活力及空肠上皮间淋巴细胞(JIL)数量评估肠道的炎症状况.实验结果表明,EGCG能有效降低肥胖大鼠体重,调节高脂饮食诱导的脂质代谢紊乱,并降低大鼠体脂率和脂肪细胞大小,改善脂肪聚集及炎症现象.同时,EGCG可降低血清LPS、DAO、TNF-α水平和空肠上皮间淋巴细胞数量,减少空肠绒毛的稀疏与断裂,增加空肠绒毛V/C值,抑制空肠绒毛中的炎细胞浸润,缓解结肠水肿现象,减少肠道通透性及炎症状况.表明EGCG能有效修复肥胖大鼠的肠黏膜屏障损伤,调节"肠-脂肪"信号轴,这可能也是其改善肥胖大鼠脂肪聚集及相关炎症的作用机制.     

越乡龙井区域公用品牌的定位策略

品牌定位是农产品区域公用品牌实现市场成功的基础。本研究运用隐喻抽取技术(ZMET)对越乡龙井消费者进行深度访谈,以挖掘消费者对于该品牌的深层感知与需求。结合手段—目的链(MEC)对访谈结果进行内容分析,构建出越乡龙井消费者价值层级图(HVM),依据HVM中较主要的三条感知链接路径为越乡龙井品牌定位提出相应的对策建议。     

伊犁河谷地域虻的鉴定及其携带伊氏锥虫的检测

为了解伊犁河谷区域虻的分布及其携带伊氏锥虫的情况,通过对虻的形态学鉴定及其特异性基因(CO1)和携带病原18S rRNA基因扩增、测序、同源性比对,鉴定和检测了采自伊犁河谷区域的虻及其携带病原情况。结果显示,所采集的虻为原虻属秋季原虻种,PCR扩增虻CO1基因和马伊氏锥虫18S rRNA基因序列分别为653 bp和205 bp。结果发现,秋季原虻的CO1基因与已发表的丹麦株(MT584147.1)同源性为98%,与形态学鉴定结果一致。在156只秋季原虻中携带伊氏锥虫的有9只,阳性率为5.7%(9/156),其阳性条带基因序列与GenBank中已发表的伊氏锥虫基因同源性为99%。试验结果表明,结合形态学分类和分子生物学方法对虻样品进行鉴定操作简单、准确度高。     

气候变化情景下流苏香竹潜在分布区预测

流苏香竹（Chimonocalamus fimbriatus）是云南特有珍稀竹种，主要分布于云南西南部。文章以野外调查获取的流苏香竹分布信息为主，运用最大熵模型（MaxEnt）同时结合地理信息系统（ArcGIS），基于19个气候因子，预测其在当前及未来气候变化情景下的潜在分布区。结果表明：当前流苏香竹的高适生区和中适生区主要分布于德宏州、保山市和临沧市等地，除迪庆州、丽江市和昭通市外，云南其他区域均有低适生区零星分布。在未来2050s和2070s的2个时间段，基于2种不同共享社会经济路径（SSP1-2.6和SSP5-8.5），流苏香竹的高适生区面积呈减少的趋势，尤其是SSP5-8.5路径下，高适生区面积仅为当前的12.51%（2050s）和18.63%（2070s）；中、低适生区在SSP1-2.6路径下，显著扩张（2050s）或略微扩张（2070s），在SSP5-8.5路径下，则大幅收缩。流苏香竹野外实际分布区及其潜在分布区均以斑块状为主，可能与云南特殊的地形、地貌有关。影响流苏香竹分布的主导气候因子为最湿月份降水量、最暖月份最高温度、最干季度降水量和平均气温日较差。流苏香竹对气候变化比较敏感，根据其野外分布状况，建议以就地保护为主、迁地保护为辅，在其潜在适生区内适当引种栽培。     

水稻低节位早发分蘖与秧苗叶片形态、碳氮代谢的关系

为了研究水稻(Oryza sativa L.)低节位早发分蘖与叶片形态、碳氮代谢之间的关系,并筛选低节位分蘖多、早期分蘖发生速率快且符合理想株型叶片形态的水稻品种(系),对31个籼亚种水稻品种(系)早期低节位的分蘖特性、叶片形态及碳氮代谢指标进行了相关性分析和聚类分析。结果表明,在正常栽培条件下,不同水稻品种(系)第一叶位成蘖率存在广泛变异,而第二、第三叶位成蘖率达到100%;水稻低节位分蘖发生速率与秧苗前3片叶叶长呈正相关,分蘖数量与叶宽呈负相关,因此,在育种上,可以将水稻秧苗前3片叶较长且较窄作为筛选早发分蘖水稻品种的参考形态指标;水稻植株体内蔗糖含量只影响分蘖发生速率,但不影响分蘖数量;硝态氮含量既影响分蘖发生速率,也影响成蘖率,氮代谢酶谷氨酸合酶(NADH-GOGAT)和谷氨酸脱氢酶(NADH-GDH)的活性能促进水稻低节位分蘖的发生;将31份水稻品种(系)进行聚类,可分为A、B、C 3类,其中C类材料是分蘖发生较早且分蘖发生速率快、叶片形态更接近于理想株型叶片形态的优质育种材料。     

fRANS HALS德国鸢尾组织培养及植株再生研究

以德国鸢尾(Iris germanica. L)FRANS HALS叶片、球茎作为外植体,利用正交试验设计研究探讨不同激素及不同浓度组合对鸢尾愈伤组织的诱导、不定芽分化以及试管苗生根的影响,为鸢尾快速繁殖、种质资源的保存及利用提供最优的技术方法。结果表明,不同外植体灭菌时间也不同,叶片为3%次氯酸钠3 min,球茎为3%次氯酸钠5 min;鸢尾组培快繁的最适合外植体为球茎;鸢尾愈伤组织诱导和芽分化的最适培养基配方为MS+NAA 0.10 mg/L+6-BA 1.00 mg/L,生根培养基为MS+1\2MS+NAA 0.10 mg/L,试管苗移栽基质采用泥炭∶珍珠岩=8∶2,成活率达90%以上。     

养殖花鳗鲡鱼皮胶原蛋白的特性分析

为了探究养殖花鳗鲡(Anguilla marmorata)鱼皮胶原蛋白的特性,利用胃蛋白酶结合酸抽提法提取花鳗鲡鱼皮胶原蛋白,SDS-PAGE电泳法展示胶原蛋白的电泳图谱,氨基酸分析仪测定胶原蛋白的氨基酸组成,分析胶原蛋白分子的紫外和红外光谱特征,用浊度实验和流变黏弹性实验探究胶原蛋白分子的体外自组装动力学特性。结果显示,花鳗鲡鱼皮胶原蛋白属于Ⅰ型胶原蛋白,氨基酸组成中甘氨酸、脯氨酸与羟脯氨酸三者的比值为8∶3∶2,胶原蛋白分子的最大紫外吸收峰出现在222.6 nm处,热变性温度28℃,红外光谱图和扫描电镜扫描结果图均表明经胃蛋白酶及酸溶得到的胶原蛋白保持了胶原原有的结构。胶原蛋白分子的体外自组装动力学曲线是含有迟滞期、成长期和稳定期的三阶段曲线。以上结果表明花鳗鲡鱼皮胶原具有接近淡水鱼皮胶原的特征。