水稻花粉小肽锌指蛋白基因OsFLZ13功能研究

FCS样锌指蛋白(FLZ)与植物的生长发育和逆境胁迫反应相关。水稻的FLZ基因家族分析和功能研究较少。本研究利用TBtools对水稻基因组Blast,鉴定到29个OsFLZ家族基因成员,并分析了相关基因位置、基因结构、motif和启动子顺式作用元件等特征。随后,通过水稻CREP数据库研究了FLZ家族成员的全生育期组织表达模式,并发现其中的OsFLZ13基因在开花前的花药中特异高水平表达。随后β-D-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色显示,OsFLZ13在花药发育的第8阶段开始表达,并在开花前的第14阶段表达量最高。用CRISPR/Cas9基因编辑获得的突变体植株结实率显著下降。相比野生型中花11的94%结实率,Osflz13-1和Osflz13-2的结实率分别只有44%和36%。本研究表明OsFLZ13参与花药发育以及花粉育性的调控,为进一步研究该基因及其家族基因的功能提供参考,同时对水稻雄性不育利用具有潜在的价值。     

水稻基因OsASIE1抗逆功能分析

作为重要的植物转录因子家族, AP2/EREBP转录因子在植物发育、激素、病原反应及非生物胁迫如干旱、高盐、低温应答方面起重要作用。本研究发现水稻AP2/EREBP转录因子家族EREBP亚家族成员OsASIE1 (abiotic stress induced EREBP gene)在水稻受到高盐、干旱胁迫时表达量迅速提高, 并且在水稻中超表达OsASIE1能够改善水稻抵抗盐胁迫的能力。凝胶迁移率实验(electrophoresis mobility shift assay, EMSA)表明该转录因子的AP2结构域能够结合干旱应答顺式作用元件DRE (dehydration-responsive element)和乙烯应答元件GCC box (ethylene response element), 推测OsASIE1可能通过结合DRE和GCC box 作用元件调控下游相关基因的表达, 进而调控相关抗逆反应。     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥REVOLUTA基因突变体的鉴定

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行定点编辑,为获得基因缺失突变体提供了新的工具。HD-ZipⅢ家族成员REVOLUTA(REV)是植物发育过程中的关键转录因子。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥REV进行特异性定点编辑,构建REV基因编辑表达载体,并利用农杆菌介导的花序浸染法将其转入拟南芥。经潮霉素抗性平板筛选和PCR扩增及测序鉴定,获得7棵转基因株系。对转基因植株REV基因的测序结果显示,有3株均成功在靶点1处产生编辑,且其中1株在靶点2处也成功编辑。该基因编辑突变体的获得为后续深入研究REV基因在拟南芥形态发育过程中的作用提供了新的遗传材料。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻miR1866突变体构建

microRNA(miRNA)是长度为18~25个碱基的非编码单链RNA,在植物生长发育过程中起着重要的调节作用。水稻是世界上重要的粮食作物之一,近年来调控水稻生长发育的miRNA不断被发掘,但目前关于miR1866的研究还比较少。本研究通过构建miR1866的CRISPR/Cas9表达载体,创制miR1866的突变体,挖掘水稻miR1866的功能。依据CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计了miR1866的突变靶点,通过人工合成的方法得到包含突变靶点的特异序列,经过磷酸化修饰和退火后与载体Sg RNA连接进而与Cas9重组得到miR1866的CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,获得转基因植株,结合测序结果判断转基因植株突变单株的突变基因型。本研究比较了野生型和突变体(KO1866-1-2和KO1866-2-4)在相同培养条件下苗期的根长、株高、茎基粗、鲜重和干重,结果表明:在营养液培养条件下,突变体的株高、根长、茎基粗、鲜重和干重均显著低于野生型。据此推测,miR1866对水稻的生长发育有一定的调节作用。本研究利用CRISPR/Cas9创制水稻miR1866的突变体,对研究miRNA调控途径,完善水稻miRNA调控的分子机制具有重要的意义。     

甜菜磷脂酰肌醇转运蛋白基因SbSEC14的克隆及低温胁迫下的表达分析

磷脂酰肌醇转运蛋白(PITPs)广泛存在于真核生物细胞中,能够在体外膜脂质双层之间调控磷脂酰肌醇(PtdIns)或者磷脂酰胆碱(PtdCho)单体的独立转运。参与磷酸肌醇代谢、膜运输、极性生长、信号转导、逆境胁迫、胞浆运动和细胞周期调节等多种重要的生命过程,在植物的逆境响应以及发育调节中具有重要的作用。为了研究甜菜磷脂酰肌醇转运蛋白基因及其在低温胁迫下的表达情况。本研究以甜菜基因组数据库中一条预测的磷脂酰肌醇转运蛋白基因CRS1为模板,用基因克隆的方法得到一条全长765 bp,开放阅读框596 bp,编码198个氨基酸的甜菜SEC14基因,命名为SbSEC14。理化性质分析表明,该蛋白质为不稳定亲水蛋白;蛋白质二、三级结构分析表明,该蛋白质α-螺旋所占的比例最高,为47.47%,β-转角所占比例最低,为5.56%;蛋白质保守结构分析表明,该蛋白质有典型的SEC14结构域;蛋白质系统进化树分析表明,甜菜SbSEC14基因与菠菜、藜麦的磷脂酰肌醇运转蛋白基因亲缘关系最近;实时荧光定量结果表明,SbSEC14基因在甜菜中组成型表达,在甜菜叶中的表达量最高,在甜菜根中的表达量最低,在叶中表达量约为根中的2.5倍。甜菜幼苗4℃处理0、2、6、12、24 h,该基因在植株处理0~2 h时表达量呈上升趋势,在植株处理2~6 h时表达量呈下降趋势,在植株处理6~24 h时表达量趋于平稳状态。因此,预测该基因与甜菜抗低温胁迫相关。     

CRISPR/Cas9系统在稻米品质改良中的应用

目前稻米品质改良已成为水稻育种的重要目标。稻米品质主要包括外观、加工、蒸煮食味和营养品质,由极其复杂的基因调控网络决定。CRISPR/Cas9系统作为新发展的定向基因编辑系统为水稻品质改良提供了重要的技术支撑,该系统具有操作简单、编辑效率高、易于多基因编辑等优点。本研究结合CRISPR/Cas9基因编辑系统及稻米品质相关基因的研究进展,详细介绍了CRISPR/Cas9基因编辑系统在稻米品种改良中的应用,讨论了该技术在水稻品质改良中存在的问题和改进策略,旨在为利用CRISPR/Cas9技术创制优质水稻新品种提供参考。     

植物PDCT基因家族的鉴定与生物信息学分析

磷脂酰胆碱甘油二酯胆碱磷酸转移酶(phosphatidylcholine diglyceride choline phosphotransferase,PDCT)参与植物种子甘油三酯(triglyceride, TAG)的合成,促进磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC)与二酰甘油(diacylglycerol, DAG)间的相互转化,其酶活的丧失显著减少种子多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)的积累。本研究通过生物信息学的手段,利用已公布在数据库中的6种油料作物(花生,甘蓝型油菜,大豆,陆地棉,芝麻和向日葵)、2种粮食作物(水稻和玉米)及1种水生植物(中国莲)的基因组信息,从中鉴定出20个PDCT同源基因,并对它们的理化性质、染色体分布、基因结构、系统进化及启动子序列分析等进行进一步的研究。结果表明,植物PDCT家族在进化上具有一定的保守性,体现在稳定的蛋白质性质和结构、保守的基因结构、保守的进化距离和保守的结构域等方面;植物PDCT家族基因拷贝数存在明显差异,受测的粮食植物及拟南芥都只有单拷贝,而受测的油料作物则几乎都是多拷贝(2个或以上);植物PDCT家族基因的表达可能受到多种发育和环境(特别是光)胁迫信号的影响,它们的启动子区域均存在很多的转录核心启动子元件及光响应顺式作用元件。本研究结果为进一步研究PDCT家族基因的育种应用提供了生物信息学参考。     

水稻膜联蛋白基因OsAnn8干旱和低温条件下表达模式以及CRISPR/Cas9定点编辑

为了阐明水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在干旱和低温胁迫条件下的功能作用机制,通过荧光定量PCR技术对不同干旱和低温处理下的水稻叶片中OsAnn8基因进行转录水平上的定量分析,结果表明,OsAnn8基因在干旱胁迫处理前后表达量呈现出高-低-高的变化趋势,而在冷胁迫处理前后表达量则呈现出低-高-低-低的变化。随后,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsAnn8基因进行定点编辑,并借助农杆菌介导将OsAnn8基因靶位点的CRISPR/Cas9基因编辑植物表达载体导入转基因受体品种TP309,经潮霉素筛选后共获得32株转基因阳性植株,靶位点扩增测序峰图分析表明其中的2个单株出现了重叠峰,进一步的T载体克隆分别测序表明,这2个单株为单等位基因敲除,说明本研究已经成功获得了OsAnn8基因靶位点敲除的单等位突变体,不同类型的水稻OsAnn8基因突变体的创建,为水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在非生物胁迫条件下的功能研究奠定了材料基础。     

亚洲棉NF-YA基因家族的全基因组鉴定及表达分析

NF-YA家族基因在植物生长发育过程中发挥重要作用,如调控种子发育和种子萌发,响应干旱和盐胁迫等。本研究利用生物信息学手段从亚洲棉全基因组鉴定NF-YA家族基因,并从理化性质、基因的内含子和外显子结构、氨基酸序列的功能结构域、系统进化发育特征、在染色体的分布和表达模式等方面分析了该家族基因的特征。结果表明:GaNF-YA包含15个成员,分布在9条染色体上,编码蛋白质长度为160～1 079个氨基酸,相对分子质量为17.92～120.30 kD,包含外显子4～6个,为碱性。亚洲棉NF-YA基因可分为三组,且三组NF-YA基因结构存在差异,保守基序分析其均含有A1和A2结构域。通过对启动子顺式作用元件和表达谱分析,推测GaNF-YA基因可能在棉花种子和纤维形成、种子萌发及环境胁迫等中具有重要作用。本研究为进一步解析亚洲棉NF-YA家族基因的功能提供理论依据。     

利用可视化CRISPR/Cas9系统获得拟南芥Cas9-free突变体

CRISPR/Cas9是实现基因精准突变的有效工具而被广泛应用到功能基因组学研究中。通常需要在已编辑后代的基因组中剔除此编辑体系,以防Cas9进一步编辑导致复杂的脱靶效应。本研究利用可视化的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除拟南芥AtPAE4基因,测序结果显示AtPAE4在第一个外显子的第478号碱基前面插入了一个碱基A,导致氨基酸的移码突变而提前终止。利用种皮特异启动子控制表达的m Cherry荧光蛋白,可以在T_1代纯合突变体种子群体中分别鉴定出发荧光和不发荧光的种子家系,抗性筛选及分子检测发现不发荧光家系为Cas9-free的AtPAE4突变家系。对AtPAE4突变体的根、茎、叶进行qPCR分析发现AtPAE4在根、茎、叶上的转录水平均显著下调。这些结果表明可视化CRISPR/Cas9系统在基因编辑后代中可快速鉴定到Cas9-free突变体植株,这有助于为进一步研究靶基因功能而获得背景清晰的编辑材料。