糖多孢菌属菌株的体内转座诱变系统

为实现糖多孢菌的体内转座诱变,采用刺糖多孢菌的强启动子促进Tn5转座酶基因tnp(5)的表达,优化链霉菌高效转座质粒pHL734,构建了转座质粒pJTn1、pJTn2、pJTn3、pJTn4、pJTn5、pJTn6。结果显示:pJTn1～pJTn6系列转座质粒均可在红色糖多孢菌中高效转座;pJTn1和pJTn5可在刺糖多孢菌中进行转座,获得31个刺糖多孢菌转座突变株;其中30个菌株的基因组中检测到标准的Tn5转座,8个突变株的多杀菌素产量显著降低。表明pJTn系列转座质粒可作为糖多孢菌的体内转座诱变工具,为抗生素的产量调控研究和高产育种靶标基因筛选提供理论依据。     

洛蒙德链霉菌S015中吩嗪类活性产物洛蒙真菌素的分离纯化、结构鉴定及发酵优化

本文对1株从土壤中新发现的链霉菌S015中的吩嗪类活性产物进行了结构鉴定及发酵优化。首先,通过16SrDNA鉴定S015为洛蒙德链霉菌。其次,通过2-丁酮萃取及制备型HPLC,在S015的发酵液中纯化得到1个活性产物,并由LC-MS和H-NMR,鉴定该产物为6-醛基-4,7,9-三羟基-吩嗪-1-甲酸酯,即洛蒙真菌素。最后,通过发酵优化,在YE培养基中添加0.1mmol/L的FeCl3,使洛蒙真菌素的产量由(20.6±4.6)mg/L提高到(136.2±18.1)mg/L,为其工业化应用奠定了基础。     

刺糖多孢菌鼠李糖和福乐糖胺合成基因的克隆和组装

鼠李糖和福乐糖胺是多杀菌素生物合成必需的2个脱氧糖结构单元,负责其合成的4种酶的基因(gtt、epi、gdh、kre)与多杀菌素生物合成基因簇并不在一起,而是分散分布在染色体的3个位点上。为克隆到完整的多杀菌素生物合成基因簇,采用构建基因组文库、PCR扩增等手段从刺糖多孢菌NRRL18395染色体分别克隆gtt、epi、gdh和kre基因,并将其克隆组装在同一整合型载体上,以便于构建用于表达多杀菌素糖单元合成基因的表达载体。     

灰红链霉菌AL7基因组文库及异源表达文库的构建

灰红链霉菌AL7对多种植物病原真菌和细菌都具有明显的抑菌活性。本研究在通用的大肠杆菌克隆宿主基础上,构建获得Dcm甲基化缺陷菌株,再引入接合转移辅助质粒pUZ8002得到菌株LP3。以LP3为宿主构建灰红链霉菌AL7的基因组粘粒文库,平均插入片段大小40kb。用高通量接合转移的方法将文库转到变铅青链霉菌TK24中,得到了异源表达文库,并从表达文库中初筛获得一些表型特异的克隆,如光秃表型、产素提前表型、产孢提前表型等。     

高产吩嗪-1-甲酰胺的绿针假单胞菌的诱变与基因工程育种

产量低是限制生物农药吩嗪-1-甲酰胺(Phenaizne-1-carboximade,PCN)推广应用的主要因素。本文综合使用诱变育种和基因工程改造来提高绿针假单胞菌的PCN产量。诱变育种使用亚硝基胍(NTG)和紫外线(UV)处理绿针假单胞菌HT66野生型菌株,以平板菌落表面的绿色PCN晶体量为指标建立高通量诱变筛选方法,通过10轮稳定可靠的诱变处理,获得的诱变高产株P3中PCN产量达到1 697mg/L,是野生菌株的3.99倍。在固体平板上培养时,P3菌株的菌落更大,PCN晶体更多且出现更早。在诱变育种的基础上进一步进行基因工程改造,敲除P3株中负调控PCN合成的rpeA基因,获得的P3ΔrpeA菌株PCN产量达到2 167mg/L,充分证明了2种育种方法结合使用的高效性。     

大肠杆菌乙酰-CoA羧化酶基因异源表达对变铅青链霉菌次级代谢的影响

克隆组装了大肠杆菌的乙酰-CoA羧化酶基因acc,以研究其异源表达对变铅青链霉菌中2种“沉默”抗生素放线紫红素和十一烷基灵菌红素合成的影响。大肠杆菌ACC由4个基因编码,通过PCR扩增4个基因,并通过重叠延伸PCR加上ermE启动子,构建得到4个重组基因;再将重组基因依次组装得到异源表达质粒pHLZ11,接合转移到变铅青链霉菌中进行异源表达。结果显示：含有异源表达质粒的变铅青链霉菌接合转移子能合成放线紫红素而十一烷基灵菌红素产量提高。表明大肠杆菌acc基因异源表达能够激活变铅青链霉菌沉默抗生素的合成,并提高已有抗生素产量。     

环氧树脂固定化环状芽孢杆菌糖氨基转移酶的研究

使用环氧树脂MC-150EP对来自环状芽孢杆菌的糖氨基转移酶BtrR进行固定化以制备光学纯β-井冈霉烯胺,在单因素试验的基础上,采用响应面试验进一步优化固定化工艺,得到最佳固定化条件:载体与蛋白质投放比例为21, pH值8.2,温度17℃,盐离子浓度460 mmol·L~(-1),固定化时间15 h,辅酶浓度0.2 mmol·L~(-1),由此制得的固定化酶比活力为20.6 U·g~(-1)(湿载体),酶活回收率为66.5%。酶学性质研究表明,固定化酶的立体选择性与游离酶相同,最适反应温度和pH值分别为39℃和8.5,热稳定性和酸碱稳定性与游离酶相比有较大提高;同时,固定化酶具有良好的操作稳定性和储存稳定性,在连续使用9个批次后,固定化酶保留初始酶活的50.5%; 4℃下连续放置20 d后,固定化酶的比活力为初始酶活的81.6%。     

毛头鬼伞子实体含氮化合物的分离纯化及结构鉴定

采用色谱柱层析法,首次从毛头鬼伞(Coprinus comatus)子实体的醇提物中分离得到8个含氮化合物,通过波谱分析,分别鉴定为尿嘧啶(uracil)、黄嘌呤(xanthine)、光色素(lumichrome)、烟酰胺(nicotinamide)、甲酰肼(formylhydrazine)、烟酸(nicotinic acid)、腺苷(adenosine)、尿苷(uridine).     

凡隆气单胞菌(Aeromonas veronii)拮抗菌4-1-3的筛选鉴定及其活性物质初探

凡隆气单胞菌是泥鳅养殖中容易发生而且致死率较高的病原菌之一.为筛选凡隆气单胞菌拮抗菌、研发防治此病害的生物制剂,采集泥鳅养殖池底泥样品,通过滤纸抑菌圈法筛选凡隆气单胞菌拮抗细菌,结合形态观察、生理生化实验和16S rRNA基因序列分析进行菌株鉴定.采用硫酸铵沉淀和离子交换层析方法分离纯化抑菌物质,电泳检测其分子量.结果显示,从样品中分离到17株细菌,其中筛选出的拮抗菌4-1-3,能够高效抑制凡隆气单胞菌,抑菌圈直径达到15.2 mm.经菌株鉴定后命名为Pseudomonas fluorescens 4-1-3.该菌产生的抑菌物质为胞外蛋白,分子量约为100 kDa,推测该物质是荧光假单胞菌产生拮抗物质的一种新类型,有望进一步研制成防治水产病害的生物制剂.     

玉米弯孢叶斑病菌全基因组分泌蛋白的预测与分析

为深入了解玉米弯孢叶斑病菌致病的分子机制,采用信号肽分析软件Signal P 4.1与PSORTb 3.0.2、跨膜螺旋结构分析软件TMHMM 2.0与THUMBUP、GPI锚定位点分析软件big-PI Predictor和亚细胞器蛋白定位分析软件Target P 1.1这6款软件综合预测该菌全基因组中10 372条蛋白序列,并对筛选出的分泌蛋白信号肽基本特征进行分析。结果表明,在玉米弯孢叶斑病菌全基因组编码蛋白中共发现804个具有典型信号肽的分泌蛋白,占全基因组蛋白总数的7.8%;编码这些蛋白的开放阅读框最小为219 bp,最大为7 113 bp,平均为1 252 bp;引导它们的信号肽长度分布在13~37 aa之间,平均为19 aa。信号肽中出现频率最高的氨基酸依次为丙氨酸、亮氨酸和丝氨酸。信号肽切割位点与根癌土壤杆菌、粗糙脉孢霉和马铃薯晚疫病菌一样,同属于A-X-A型。70个具有功能描述的分泌蛋白主要是和细胞代谢与转运、信号转导有关的酶类;还有一些降解细胞壁组分及与致病相关的酶类,可能与玉米弯孢叶斑病菌的毒性有关。